DB34 T 2812-2017 水稻稻曲病菌 PCR 快速筛查法.pdf
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1、ICS 65.020.01 B 16 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 28122017 水稻稻曲病菌 PCR 快速筛查法 PCR Rapid Screening Method of Ustilaginoidea virens (Cook) Takahashi 文稿版次选择 2017 - 03 - 30 发布 2017 - 04 - 30 实施 安徽省质量技术监督局 发布 DB34/T 28122017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位
2、:安徽省检验检疫科学技术研究院、安徽省农科院植物保护与农产品质量安全 研究所。 本标准主要起草人:陈雪娇、李云飞、宗凯、杨雪、孙娟娟、陈雨、郑海松、余晓峰、姚剑。 DB34/T 28122017 1 水稻稻曲病菌 PCR 快速筛查法 1 范围 本标准规定了水稻种子中稻曲病菌的PCR快速筛查法。 本标准适用于水稻种子中稻曲病菌的快速筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 基本信息 学名:水稻稻曲
3、病菌。无性态为 Ustilaginoidea virens (Cook) Takahashi,子囊菌门 (Ascomycota) , 粪壳菌纲 (Sordariomycetes) , 肉座菌目 (Hypocreales) , 麦角菌科 (Clavicipitaceae) , 绿核菌属( Ustilaginoidea)。有性态为稻麦角菌 Claviceps oryzae-sativae Has。 别名:假黑穗病、绿黑穗病、青粉病等。 传播途径:该菌以菌核和厚垣孢子的形式在病残体上或土壤中越冬,可随种子进行长距离传播。见 附录A。 4 方法和原理 本标准是通过洗涤法收集可能夹杂在稻种中的水稻稻曲病
4、菌孢子及其 DNA, 利用水稻稻曲病菌特异 性引物对孢子释放的 DNA 进行 PCR 扩增,通过能否得到特异性条带判定稻种中是否带有水稻稻曲病 菌。 5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 往复式振荡器、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR 仪、凝胶成像系统、 电泳仪、旋涡振荡器等。 5.2 主要试剂 吐温 20,无菌去离子水,商品化 2 PCR 反应预混夜,琼脂糖,TAE,Loading Buffer,EB。除另 有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂,实验用水应符合 GB/T 6682 的规定。 6 鉴定方法 DB34/T 28122017 2 6.1 洗涤 将稻种
5、混匀后称取 50 g 倒入经干热灭菌的 250 mL 三角烧瓶中,加入 100 mL 无菌去离子水和一 至二滴表面活性剂吐温 20,用封口膜封口。将三角烧瓶放在往复式振荡器上振荡 10 min 后取下三角 烧瓶,将悬浮液注入干热灭菌的 10 mL20 mL 刻度离心管内离心( 4000 rpm/min)5 min。取出离心 管,弃上清,再加剩余悬浮液,重复离心,直至所有悬浮液离心完毕,留沉淀物及少量上清液(总体积 不超过 500 L)。弃上清过程中尽量动作轻柔,避免沉淀物悬浮。 6.2 孢子裂解 将 6.1 中沉淀物及上清液悬浮混匀,连管一起置于沸水浴 15 min。冷却后备用。 6.3 PC
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