1、ICS 65.020.01 B 16 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 28122017 水稻稻曲病菌 PCR 快速筛查法 PCR Rapid Screening Method of Ustilaginoidea virens (Cook) Takahashi 文稿版次选择 2017 - 03 - 30 发布 2017 - 04 - 30 实施 安徽省质量技术监督局 发布 DB34/T 28122017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位
2、：安徽省检验检疫科学技术研究院、安徽省农科院植物保护与农产品质量安全 研究所。 本标准主要起草人：陈雪娇、李云飞、宗凯、杨雪、孙娟娟、陈雨、郑海松、余晓峰、姚剑。 DB34/T 28122017 1 水稻稻曲病菌 PCR 快速筛查法 1 范围 本标准规定了水稻种子中稻曲病菌的PCR快速筛查法。 本标准适用于水稻种子中稻曲病菌的快速筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 基本信息 学名：水稻稻曲
3、病菌。无性态为 Ustilaginoidea virens (Cook) Takahashi，子囊菌门 （Ascomycota） ， 粪壳菌纲 （Sordariomycetes） ， 肉座菌目 （Hypocreales） ， 麦角菌科 （Clavicipitaceae） ， 绿核菌属（ Ustilaginoidea）。有性态为稻麦角菌 Claviceps oryzae-sativae Has。 别名：假黑穗病、绿黑穗病、青粉病等。 传播途径：该菌以菌核和厚垣孢子的形式在病残体上或土壤中越冬，可随种子进行长距离传播。见 附录A。 4 方法和原理 本标准是通过洗涤法收集可能夹杂在稻种中的水稻稻曲病
4、菌孢子及其 DNA， 利用水稻稻曲病菌特异 性引物对孢子释放的 DNA 进行 PCR 扩增，通过能否得到特异性条带判定稻种中是否带有水稻稻曲病 菌。 5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 往复式振荡器、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR 仪、凝胶成像系统、 电泳仪、旋涡振荡器等。 5.2 主要试剂 吐温 20，无菌去离子水，商品化 2 PCR 反应预混夜，琼脂糖，TAE，Loading Buffer，EB。除另 有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合 GB/T 6682 的规定。 6 鉴定方法 DB34/T 28122017 2 6.1 洗涤 将稻种
5、混匀后称取 50 g 倒入经干热灭菌的 250 mL 三角烧瓶中，加入 100 mL 无菌去离子水和一 至二滴表面活性剂吐温 20，用封口膜封口。将三角烧瓶放在往复式振荡器上振荡 10 min 后取下三角 烧瓶，将悬浮液注入干热灭菌的 10 mL20 mL 刻度离心管内离心（ 4000 rpm/min）5 min。取出离心 管，弃上清，再加剩余悬浮液，重复离心，直至所有悬浮液离心完毕，留沉淀物及少量上清液（总体积 不超过 500 L）。弃上清过程中尽量动作轻柔，避免沉淀物悬浮。 6.2 孢子裂解 将 6.1 中沉淀物及上清液悬浮混匀，连管一起置于沸水浴 15 min。冷却后备用。 6.3 PC
6、R 特异性检测 6.3.1 DNA 模板 将 6.2 中制备的孢子裂解产物直接作为稻曲病菌 PCR 特异性检测的 DNA 模板。 6.3.2 引物 针对水稻稻曲病菌与其他属种病菌 ITS 序列差异设计了一对特异性引物。uvr-F： 5-CTTGTGTTTTCCAATGCATGT-3； uvr-R：5 -CAAGTGCGAGGATAACTGAAT-3。引物由提供商品化服务的公 司合成。该引物 PCR 扩增的特异性条带大小为 346bp。 6.3.3 反应体系 用 uvr F 和 uvr R 对分离纯化的菌株 DNA 进行 PCR 反应，反应体积 50 L: 2PCR 反应预 混夜 25 L、10
7、 M 引物各 2 L、模板(按照 6.3.1 制备) 4 L，无菌去离子水补足至 50 L。将反 应体系混匀后置于 PCR 仪中进行反应。 以灭菌去离子水为空白对照，以水稻稻曲病菌 DNA 为阳性对照，以其他病菌 DNA 为阴性对照，每 个样品重复 2 次。 6.3.4 PCR 扩增条件 94 5 min； 94 30 s， 61 30 s， 72 30 s， 30个循环； 72 5 min。反应结束后 电泳 分析 PCR 产物。 7 结果判定 在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下： 待测样品扩增出 346 bp 左右的条带，则判定为该样品水稻稻曲病菌 PCR 筛查结果为阳性。 待
8、测样品未扩增出 346 bp 左右的条带，则判定该样品水稻稻曲病菌 PCR 筛查结果为阴性。 8 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对水稻稻曲病菌 PCR 检测结果为阳性的样品应保存于 4 冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌（121 15 min）后方可处理。 DB34/T 28122017 3 A A 附 录 A （资料性附录） 水稻稻曲病相关资料 A.1 分布地区 水稻稻曲病已广泛分布于世界水稻产区，其中以菲律宾、日本和印度发生最为严重。在国内主要分 布于江苏、浙江、安徽、广东、广西、湖北、湖南、四川、北京、天津、黑龙江、辽宁、陕西等地。 B A.1 分布地区
9、 A.2 为害状 水稻稻曲病只发生在水稻穗部，为害部分谷粒。病菌侵入后，初期在颖壳外形成乳白色的薄膜包被 的扁平球状，颖壳内部在解剖镜下可见白色菌丝，菌丝会在谷粒内胚外层形成白色的菌丝块，随着菌丝 块逐渐膨大，内外颖裂开，露出淡黄色孢子座，然后包在内外颖两侧，不断增大，最后将花序包裹，形 成了大于正常谷粒 34 倍的黄绿色至墨绿色的稻曲球（见图A.1），稻曲球外覆盖有一层银灰色薄膜， 成熟后薄膜破裂，散出黄绿色的厚垣孢子粉末。老熟的稻曲球表面硬，子座龟裂绽开，外表形似松果。 图A.1 水稻稻曲菌病为害状 稻曲球的切片观察（见图A.2）表明，菌丝与稻 粒的胚乳层界限分明，大部分稻曲球中部有大块的
10、 发育良好的胚乳， 并充满密集的淀粉粒。 根据稻曲球中病菌发育程度的不同， 从内到外可以分为 3 层： 最里层浅黄色，由放射状生长的菌丝和正在形成的厚垣孢子组成；中间一层是橘黄色，由菌丝和孢子构 成；最外层绿色至墨绿色，由成熟的孢子和老熟的菌丝组成。病粒上常有菌核存在，扁平状，表面黑色。 菌核未常熟时在病粒内侧，成熟后外露，易脱落。一般 1 个病粒含有 1 个菌核，有的病粒含有 24 个菌核。 图A.2 稻曲球切面图 DB34/T 28122017 4 A.3 培养特征 该菌在培养基平板上生长速度较慢，26在 PDA 上日生长速率为 2 mm/d 左右。培养过程中最先 在分离组织上产生肉眼可见
11、的黄色或白色菌落（见图 A.3），随着培养天数增加，菌落颜色不断加深变 成黄绿色、深绿色至墨绿色，有时在菌落边缘还会形成比菌落颜色深的色素带。子座颜色为橄榄绿至墨 绿色，成熟后表面龟裂成凹凸不平的形状。该 病菌在稻曲球中和 PDA 培养基上均能产生厚垣孢子（培 养 20 d 左右）（见图A.4），大小为 4.0 m7.8 m3.0 m7.0 m，圆形或略椭圆形，壁厚，黄 至黑褐色，表面粗糙，具有瘤刺状凸起。 图A.3 稻曲菌菌落形态（ PDA 培养基 26 培养 14d） 图A.4 厚垣孢子（A）与薄壁分生孢子（B） 薄壁分生孢子与子囊孢子较为少见。分生孢子无色， 卵圆形或椭圆形，大小为 3.0 m7.0 m 4.0 m8.0 m，新生的分生孢子比老熟的分生孢子小，胞内基质均匀，成熟的分生孢子壁厚，胞内 基质浓度增大，颜色变深。每个子囊壳中约有 300 个左右的圆柱状子囊，每个子囊中有 8 个线形子囊 孢子。子囊孢子单胞无色，线状，易折断，大小为 52.0 m176.8 m0.52 m1.04 m，表面光滑 无特殊结构。 _
