SN T 2641-2010 食品中常见致病菌检测 PCR-DHPLC法.pdf

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1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准G21 G22G21G23 G21 G22 G23 G24G22G21 G25 G24 G25食品中常见致病菌检测G24 G25 G26 G27 G28 G29 G24 G2A G25法G28 G2BG2C G2B G2D G2CG2E G2F G30 G2F G31G32G33 G2C G34 G2FG35G2B G30 G2E G30 G31 G2F G2F G36G22G24 G25 G26 G27 G28 G29 G24 G2A G25 G37 G2BG2C G34 G2F G36G21 G25 G24 G25 G27 G24 G24 G27

2、G25 G24发布G21 G25 G24 G24 G27 G25 G26 G27 G25 G24实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前言本标准按照给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国江西出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、北京盈九思科技发展有限公司。本标准主要起草人：曹际娟、郑秋月、徐君怡、黄晓蓉、耿丽梅、孙哲平、王旭、于畅、邵碧英、郑晶、杨春华、王振国、高晓博。犛犖犜食品中常见致病菌检测犘犆犚犇犎犘犔犆法范围本标准规定了食品中沙

3、门氏菌等种致病菌的检测方法。本标准适用于食品中沙门氏菌等种致病菌的快速检测。注：种常见致病菌包括：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、嗜热弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠致病性大肠埃希氏菌、肠侵袭性大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、梅氏弧菌、嗜水气单胞菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌、溶血性链球菌、布鲁氏杆菌、乳酸杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日

4、期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法实验室生物安全通用要求实验室质量控制规范食品分子生物学检测缩略语下列缩略语适用于本文件。（）：脱氧核糖核酸（）：脱氧核苷酸三磷酸（）：变性高效液相色谱（）：聚合酶链式反应犜犪狇（犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌）：水生栖热菌：三乙基铵醋酸盐生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按照中的有关规定执行。废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物需经高压灭菌处理至少后再弃置。检测过程中防止交叉污染的措施参照标准执行。犛犖犜原理

5、分析技术是应用离子对反相液相色谱原理对片段进行分离。离子对采用三乙基胺醋酸盐缓冲溶液（），核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时分子中的三个乙基与固定相表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。试剂和材料除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯。水为灭菌超纯水，符合中一级水的规格。所有试剂均用无酶污染的容器分装。犜犪狇聚合酶。：、。缓冲液：（），氯化钾，氯化镁。引物：引物序列见附录表。溶液。蛋白酶（）。氯化钠（）：和。三氯甲烷。异戊醇。酚。异丙醇。乙醇。缓冲液：缓冲溶液为和乙腈混合，加水定容至；缓冲

6、溶液为和乙腈混合，加水定容至；缓冲溶液为乙腈。主要仪器和设备仪。仪。高速离心机：离心转速犵。超净工作台。微量可调移液器和灭菌吸头：、。灭菌反应管。方法提要与检测程序方法提要本方法利用非变性条件下的分离技术，灵敏地检测扩增产物进行细菌鉴定分析，不同的细菌显示特异的吸收峰，从而对食品中的致病菌进行快速检测。犛犖犜检测流程致病菌检测流程见图。图变性高效液相色谱法检测致病菌流程图操作步骤样品制备、增菌培养和分离参照附录中的相关国家标准、行业标准或国际权威标准方法进行增菌和分离培养。模板犇犖犃的制备增菌液模板犇犖犃的制备取中培养的相应致病菌增菌液（需二次培养的则取二次增菌液），加到无菌离心管中，犵离心；

7、吸弃上清液，取沉淀，加溶液（），悬浮，加和蛋白酶（），混匀，温浴；加氯化钠（），混匀，加溶液（和氯化钠），混匀，温浴；加等体积三氯甲烷异戊醇（体积比为），混匀，犵离心；取上清液，加等体积酚三氯甲烷异戊醇（体积比为犛犖犜），混匀，犵离心；取上清液，加倍体积异丙醇，轻轻混匀，犵离心；取沉淀，用乙醇清洗次，干燥，加溶液（）溶解，此即为溶液。若不能立即检测，可保存于备用。按同样方法制备阳性对照菌株和阴性对照菌株的增菌液模板。也可使用商业化的提取试剂盒并按其说明制备模板。可疑菌落模板犇犖犃的制备挑取中分离到的可疑菌落或菌体，或其传代培养液，按照步骤制备模板以待检测。也可使用商业化的提取试剂盒并按其说明制

8、备模板。犘犆犚扩增反应体系体积为：缓冲液、正义引物和反义引物（）各、（）、犜犪狇聚合酶（）、水、模板（）。反应条件：预变性；变性，退火，延伸，进行个循环；延伸，保存反应产物。将产物进行分析。注：反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。犇犎犘犔犆检测犇犎犘犔犆分析条件分析条件如下：）色谱柱：色谱柱（，粒度）；）柱温：；）流动相：缓冲溶液浓度为，缓冲溶液浓度为；）流速：；）分析片断设计：起始碱基数：扩增目标的预期片段减去；终止碱基数：扩增目标的预期片段加上；）检测器：荧光检测器（光源：灯；激发谱带宽：；发射谱带宽：；检测灵敏度：在波长积分）；）上样量：产物。犇犎犘犔犆分析步骤将装有产物的

9、反应管放置在金属板的微孔中。登录分析系统，按照设置分析条件，建立检测程序并运行。质控对照设置检测过程中应分别设阳性对照和阴性对照。阳性对照为目标致病菌的标准菌株，阴性对照为非目标致病菌的标准菌株。结果及判断质控标准阴性对照：无吸收峰出现。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售阳性对照：出现典型的产物吸收峰，且峰吸收值大于。不符合上述对照质控标准的视为无效。结果判定和报告以沙门氏菌为例，检测图谱示例，参见附录：）检测样品无扩增吸收峰出现，可判定样品结果为阴性，直接报告未检出致病菌；）检测样品出现典型的产物吸收峰，且吸收峰值大于时，可判定该样品致病菌为可疑阳性；）检测样品出现典型的产物吸收峰，但吸收峰

10、值小于时，建议调整扩增参数重新进行检测。重做结果吸收峰值仍小于则为致病菌阴性，否则为致病菌可疑阳性；）对于致病菌可疑阳性结果，应参见附录中的相关经典检测方法做进一步的生化鉴定和报告。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售附录犃（规范性附录）食品中常见致病菌犘犆犚犇犎犘犔犆检测所用引物序列表犃食品中常见致病菌犘犆犚犇犎犘犔犆检测所用引物序列序号基因名称致病菌名称引物序列预期片段大小沙门氏菌志贺氏菌金黄色葡萄球菌小肠结肠炎耶尔森氏菌单核细胞增生李斯特氏菌空肠弯曲菌嗜热弯曲菌（空肠弯曲菌和结肠弯曲菌）肠出血性大肠埃希氏菌产肠毒素大肠埃希氏菌肠致病性大肠埃希氏菌肠侵袭性大肠埃希氏菌阪崎肠杆菌溶血性链球菌副

11、溶血性弧菌犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售表犃（续）序号基因名称致病菌名称引物序列预期片段大小霍乱弧菌创伤弧菌溶藻弧菌拟态弧菌河流弧菌梅氏弧菌蜡样芽孢杆菌肉毒梭菌（）（）（）（）（）（）（）（）（）产气荚膜梭菌布鲁氏杆菌肺炎克雷伯氏菌乳酸杆菌绿脓杆菌嗜水气单胞菌普通变形杆菌奇异变形杆菌犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售附录犅（资料性附录）标准清单食品安全国家标准食品卫生微生物检验沙门氏菌检验食品卫生微生物检验志贺氏菌检验食品卫生微生物检验致泻大肠埃希氏菌检验食品卫生微生物检验副溶血性弧菌检验食品卫生微生物检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验食品卫生微生物检验空肠弯曲菌检验食品安全国家标准食品卫生微生

12、物检验金黄色葡萄球菌检验食品卫生微生物检验溶血性链球菌检验食品卫生微生物检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验食品卫生微生物检验产气荚膜梭菌检验食品卫生微生物检验蜡样芽孢杆菌检验食品安全国家标准食品卫生微生物检验单核细胞增生李斯特氏菌检验食品安全国家标准食品卫生微生物检验乳酸菌检验食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌检验食品安全国家标准食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验出口食品中弯曲杆菌检验方法进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法出口食品中嗜水气单胞菌检验方法出口食品中霍乱弧菌检验方法食品中克雷伯氏菌检测方法食品中致病性弧菌的检测和计数犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售附录犆（资料性附录）食品中致病菌犇犎犘犔犆检测图谱示例犆以沙门氏菌为例的犇犎犘犔犆检测图谱犆犇犎犘犔犆分析条件犆色谱柱：色谱柱（，粒度）。犆柱温：。犆流动相：缓冲溶液浓度为，缓冲溶液浓度为。犆流速：。犆检测器：荧光检测器（光源：灯；激发谱带宽：；发射谱带宽：；检测灵敏度：在波长积分）。犆上样量：产物。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准食品中常见致病菌检测犘犆犚犇犎犘犔犆法中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街号邮政编码：网址电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本印张字数千字年月第一版年月第一次印刷印数书号：定价元版权所有 禁止翻制、电子发售