2018_2019高中生物第4章现代生物技术4.2蛋白质的提取和分离课件北师大版选修1.ppt

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1、第2节 蛋白质的提取和分离,1.简述蛋白质提取的基本过程和方法。 2.记住电泳法等分离蛋白质的基本原理。,一,二,一、同工酶以及乳酸脱氢酶 1.同工酶 指催化相同的化学反应,而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。 2.乳酸脱氢酶 (1)种类:一般含有5种同工酶。 (2)特点:相对分子质量相同,但所带电荷不同,电泳结果应该形成5个条带。,一,二,二、乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离 1.提取原理 乳酸脱氢酶同工酶可以与特定的底物进行反应,形成特殊的蓝紫色产物。同工酶检测必须依靠其具有催化活性的特点,从而使其和其他的可溶性蛋白质区分开来。因此在提取此类蛋白质时必须提供必要的缓冲系统和

2、低温环境以保持其生物活性。,一,二,2.分离原理 蛋白质在立体网状的琼脂糖凝胶中电泳时,其迁移率主要取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。因此,乳酸脱氢酶同工酶可以通过电泳分开。 思考： 可否利用蛋白质的提取与分离技术快速诊断早期癌变? 提示:可以。只需从早期患者的尿液、血液或细胞裂解液中提取少量蛋白质样品,采用蛋白质指纹图谱技术,就可以更加快速、简便、准确地对细胞癌变作出诊断。 3.实验步骤 (1)提取过程:制备匀浆获取酶。 (2)分离过程:制琼脂糖凝胶电泳板加样、电泳染色、观察。,1.蛋白质分离提纯技术 将生物体内的蛋白质提取出来并加以分离,就可以得到高纯度的,甚至是单一种类的蛋白

3、质。 目前常用的蛋白质分离提纯技术包括离心技术、层析技术和电泳技术等。其中,电泳技术最为快捷灵敏、简便易行。 蛋白质含有游离的氨基和羧基,是两性电解质,在一定pH条件下带有电荷。作为带电粒子,蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相反的电极方向移动,这就是电泳现象。蛋白质所带的电荷数越多,移动得越快;电荷数相同时,相对分子质量越小,则移动越快。这就是利用电泳技术分离蛋白质的原理。,2.聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳需要支持物,常用的是聚丙烯酰胺凝胶,由此而来的技术称为聚丙烯酰胺凝胶电泳,简称PAGE。 不同蛋白质的混合溶液,在经过同一个电场电泳后,会在凝胶上形成不同的带纹。每一种带纹可能就是一种蛋白质

4、。如果要对每一个带纹做进一步的研究,只需将这些带纹一个一个地剪下来,分别予以洗脱,然后对洗脱液中的蛋白质做进一步的分离。如果待测洗脱液不能再分离,则这个带纹中很可能只含有一种单纯蛋白质。如果待测洗脱液还能再分离,则这个带纹中含有多种蛋白质,需要进一步分离,直至提纯。,3.用凝胶色谱法分离血红蛋白的过程 凝胶色谱法也称分配色谱法,是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由多糖类化合物构成的微小多孔球体,在小球体内部有许多贯穿的通道,相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同。相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢;而相对分子质量较大的蛋白

5、质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 凝胶色谱的操作:第一步要制作凝胶色谱柱。第二步要装填凝胶色谱柱,因为干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别很大,所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时,不得有气泡存在,因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。第三步是样品的加入和洗脱。,特别提醒不是所有种类的蛋白质的提取和分离都用同一种方法,蛋白质的来源和性质不同,分离方法差别很大。,4.缓冲溶液 在一定范围内,能对抗少量外来强酸、强碱或具有稍加稀释不引起溶液pH明显变化的作用叫做缓冲作用

6、,具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一种或两种化合物(缓冲剂)溶解于水中制得的,调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH基本不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的,受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境,就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程相同的pH。,题型一,题型二,电泳技术的原理与操作 【例题1】 下列关于电泳的说法,不正确的是( ) A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B.带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 C.蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它

7、所带净电荷的多少 D.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子相对质量的大小 解析:蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小和形状等因素。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物,SDS 所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异,使电泳迁移率完全取决于分子相对质量的大小。 答案:C,题型一,题型二,反思领悟电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质不同以及分子本身的大小、形状不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。,题型一,题型二,蛋白质的提取和分离 【例题2】 以下关于猪血红

8、蛋白提纯的描述,不正确的是 ( ) A.洗涤红细胞时,使用生理盐水可防止红细胞破裂 B.猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核,提纯时杂蛋白较少 C.血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测 D.在凝胶色谱法分离过程中,血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移动慢 解析:凝胶色谱法分离时,大分子物质由于分子直径较大,不易进入凝胶颗粒的微孔,而只能分布于凝胶颗粒之间,所以在洗脱时向下移动的速度较快,相反,相对分子质量较小的物质向下移动速度较慢。 答案:D,1,2,3,4,5,1.电泳过程中,什么样的分子迁移速度最快?( ) A.纤维状、大分子 B.纤维状、小分子 C.球状、大分子 D.球状、小分子 答

9、案:D 解析:电泳就是利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同。一般来说,球状分子比纤维状分子移动快,小分子比大分子移动快。,1,2,3,4,5,2.下列说法不正确的是( ) A.在一定范围内,缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变 B.缓冲溶液通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成 C.透析袋能使小分子自由进出,而将大分子保留在袋内 D.乳酸脱氢酶一般含有4种同工酶 答案:D 解析:乳酸脱氢酶一般含有5种同工酶,其相对分子质量相同,但所带电荷不同。,1,2,3,4,5,3.蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述不正确的是

10、( ) A.根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性,可将样品中各种不同的蛋白质分离 B.根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等,可通过电泳分离蛋白质 C.根据蛋白质相对分子质量的大小,可通过凝胶色谱法分离蛋白质 D.根据蛋白质的分子大小、密度不同,可通过离心沉降法分离蛋白质 答案:A 解析:蛋白质分子不能透过半透膜,据此可利用半透膜除去样品中相对分子质量小的杂质。,1,2,3,4,5,4.使用凝胶色谱法分离蛋白质的实验中,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程,可表示为图中( )答案:B 解析:本题考查对凝胶色谱法分离蛋白质原理的理解。相对分子质量较大的蛋白质留在凝胶颗粒外面,相对分子质量较

11、小的蛋白质进入凝胶颗粒内部;相对分子质量大的蛋白质通过凝胶间隙先被洗脱,相对分子质量小的蛋白质进入凝胶内部而后被洗脱。,1,2,3,4,5,5.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时,一定要加入缓冲溶液,其作用主要是( ) A.使酶的活力最高 B.使蛋白质的活力最高 C.维持蛋白质所带的电荷 D.使蛋白质带上电荷 答案:C 解析:蛋白质具有两性,在一定pH下,蛋白质分子的某些基团会带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。因此,加缓冲溶液的目的是维持蛋白质所带的电荷不发生改变。,