DIN CEN ISO TS 13136-2013 Microbiology of food and animal feed - Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens - Horizontal methoh.pdf

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1、April 2013 Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 14DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 07.100.30Zur Erstellung e

2、iner DIN SPEC knnen verschiedene Verfahrensweisen herangezogen werden: Das vorliegende Dokument wurde nach den Verfahrensregeln einer Vornorm erstellt.!$tU8“1815021www.din.deDDIN CEN ISO/TS 13136Alleinverkauf der Spezifikationen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 31 Seite

3、nDIN SPEC 107Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln RealtimePolymeraseKettenreaktion (PCR) zum Nachweis von pathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln Horizontales Verfahren fr den Nachweis von ShigaToxin bildenden Escherichia coli (STEC) und Bestimmung der Serogruppen O157, O111, O26, O

4、103 und O145 (ISO/TS 13136:2012); Deutsche Fassung CEN ISO/TS 13136:2012 Microbiology of food and animal feed Realtime polymerase chain reaction (PCR)based method for the detection of foodborne pathogens Horizontal method for the detection of Shiga toxinproducing Escherichia coli (STEC) and the dete

5、rmination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups (ISO/TS 13136:2012);German version CEN ISO/TS 13136:2012 Microbiologie des aliments Mthode base sur la raction de polymrisation en chane (PCR) en temps rel pour la dtection des microorganismes pathognes dans les aliments Mthode horizontale pour

6、la dtection des Escherichia coli producteurs de Shigatoxines (STEC) et la dtermination des srogroupes O157, O111, O26, O103 et O145 (ISO/TS 13136:2012); Version allemande CEN ISO/TS 13136:2012 94a DIN CEN ISO/TS 13136 (SPEC 10794):2013-04 2 Nationales Vorwort Eine DIN SPEC nach dem Vornorm-Verfahren

7、 ist das Ergebnis einer Normungsarbeit, das wegen bestimmter Vorbehalte zum Inhalt oder wegen des gegenber einer Norm abweichenden Aufstellungsverfahrens vom DIN noch nicht als Norm herausgegeben wird. Zur vorliegenden DIN SPEC wurde kein Entwurf verffentlicht. Erfahrungen mit dieser DIN SPEC sind e

8、rbeten vorzugsweise als Datei per E-Mail an naldin.de in Form einer Tabelle. Die Vorlage dieser Tabelle kann im Internet unter http:/www.din.de/stellungnahme abgerufen werden; oder in Papierform an den Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN Deutsches Institut fr N

9、ormung e. V., Burggrafenstrae 6, 10787 Berlin. Dieses Dokument enthlt unverndert die Internationale Technische Spezifikation ISO/TS 13136:2012, die vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren“ (Sekretariat: DIN, Deutschland) in Zusammenarbeit mit dem ISO/TC 34 Food

10、products“ (Sekretariat: AFNOR/ABNT, Frankreich/Brasilien) erarbeitet wurde und auch als Europische Technische Spezifikation CEN ISO/TS 13136:2012 vorliegt. Die Mitarbeit des DIN in den zustndigen Gremien Arbeitsgruppe WG 6 Mikrobiologie der Lebensmittelkette“ des CEN/TC 275 und des SC 9 Food product

11、s Microbiology“ des ISO/TC 34 wird ber den Arbeits-ausschuss NA 057-01-06 AA Mikrobiologische Lebensmitteluntersuchung einschlielich Schnellverfahren“ des Normenausschusses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) wahrgenommen. Fr die in diesem Dokument zitierten internationalen Dokumente

12、 wird im Folgenden auf die entsprechenden deutschen Dokumente hingewiesen: ISO 7218 siehe DIN EN ISO 7218 ISO 20838 siehe DIN EN ISO 20838 ISO 22174 siehe DIN EN ISO 22174 Nationaler Anhang NA (informativ) Literaturhinweise DIN EN ISO 7218, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Allgemein

13、e Anforderungen und Leitlinien fr mikrobiologische Untersuchungen DIN EN ISO 20838, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von pathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln Anforderungen an Amplifikation und Nachweis bei qualitativen Verfahren DI

14、N ISO/TS 22174, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von pathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln Allgemeine Anforderungen und Begriffe TECHNISCHE SPEZIFIKATION TECHNICAL SPECIFICATION SPCIFICATION TECHNIQUE CEN ISO/TS 13136 November 2012

15、ICS 07.100.30 Deutsche Fassung Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Real-time-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von pathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln Horizontales Verfahren fr den Nachweis von Shiga-Toxin bildenden Escherichia coli (STEC) und Bestimmung der Serogrup

16、pen O157, O111, O26, O103 und O145 (ISO/TS 13136:2012) Microbiology of food and animal feed Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O

17、157, O111, O26, O103 and O145 serogroups (ISO/TS 13136:2012) Microbiologie des aliments Mthode base sur la raction de polymrisation en chane (PCR) en temps rel pour la dtection des micro-organismes pathognes dans les aliments Mthode horizontale pour la dtection des Escherichia coli producteurs de Sh

18、igatoxines (STEC) et la dtermination des srogroupes O157, O111, O26, O103 et O145 (ISO/TS 13136:2012) Diese Technische spezifikation (CEN/TS) wurde vom CEN am 16. Juli 2012 als eine knftige Norm zur vorlufigen Anwendung angenommen. Die Gltigkeitsdauer dieser CEN/TS ist zunchst auf drei Jahre begrenz

19、t. Nach zwei Jahren werden die Mitglieder des CEN gebeten, ihre Stellungnahmen abzugeben, insbesondere ber die Frage, ob die CEN/TS in eine Europische Norm umgewandelt werden kann. Die CEN Mitglieder sind verpflichtet, das Vorhandensein dieser CEN/TS in der gleichen Weise wie bei einer EN anzukndige

20、n und die CEN/TS verfgbar zu machen. Es ist zulssig, entgegenstehende nationale Normen bis zur Entscheidung ber eine mgliche Umwandlung der CEN/TS in eine EN (parallel zur CEN/TS) beizubehalten. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, der eh

21、emaligen jugoslawischen Republik Mazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechische

22、n Republik, der Trkei, Ungarn, dem Vereinigten Knigreich und Zypern. EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMIT EUROPEN DE NORMALISATION Management-Zentrum: Avenue Marnix 17, B-1000 Brssel 2012 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Ver

23、fahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten. Ref. Nr. CEN ISO/TS 13136:2012 D CEN ISO/TS 13136:2012 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort 3Einleitung .41 Anwendungsbereich .52 Normative Verweisungen 53 Begriffe .64 Kurzbeschreibung .64.1 Allgemeines 64.2 Mikrobielle Anreicherung 64.3 N

24、ukleinsureextraktion .74.4 Ziel-Gene .74.5 Nachweis 74.6 Isolierung 75 Verdnnungsmittel, Nhrmedien und Reagenzien 85.1 Nhrmedien 85.2 Reagenzien fr die Nukleinsureextraktion 95.3 Reagenzien fr die PCR 96 Ausrstung .97 Probenahme 108 Vorbereitung der Untersuchungsprobe . 109 Durchfhrung 109.1 Einwaag

25、e und Erstverdnnung . 109.2 Anreicherung . 119.3 Nukleinsureextraktion 119.4 Amplifikation mittels PCR (Real-time-PCR) . 119.5 Isolierung von Stmmen 1210 Auswertung . 1211 Leistungsdaten . 13Anhang A (normativ) Flieschema fr das Screeningverfahren . 18Anhang B (normativ) Flieschema fr das Isolierung

26、s- und Besttigungsverfahren . 19Anhang C (informativ) Identifizierung von Shiga-Toxin bildenden Escherichia coli (STEC) durch Amplifikation von Virulenzgenen mittels Multiplex-PCR und Nachweis von PCR-Produkten mit Agarose-Gelelektrophorese 20Anhang D (informativ) Interne Amplifikationskontrolle 24A

27、nhang E (informativ) Primer und Sonden fr den PCR-Assay 25Anhang F (normativ) Isolierung von STEC-Stmmen . 27Literaturhinweise . 28DIN CEN ISO/TS 13136 (SPEC 10794):2013-04 CEN ISO/TS 13136:2012 (D) 3 Vorwort Dieses Dokument (CEN ISO/TS 13136:2012) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmitt

28、el-analytik Horizontale Verfahren“, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird, in Zusammenarbeit mit dem Technischen Komitee ISO/TC 34 Food products“ erarbeitet. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. CEN und/oder CENELEC sind nicht dafr

29、 verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diese Technische Spezifikation anzukndigen: Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, die ehemalige jugosl

30、awische Republik Mazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Trkei, Ungarn, Vereini

31、gtes Knigreich und Zypern. DIN CEN ISO/TS 13136 (SPEC 10794):2013-04 CEN ISO/TS 13136:2012 (D) 4 Einleitung Shiga-Toxin bildende Escherichia coli (STEC) sind pathogene E. coli, die beim Menschen Diarrhoe (Durchfall) sowie schwerere Erkrankungen hervorrufen knnen, wie z. B. enterohmorrhagische Coliti

32、s und hmolytisch-urmisches Syndrom (HUS). Obwohl STEC zu einer groen Zahl von Serogruppen gehren knnen, gehren die, die eindeutig mit den schwersten Formen der Erkrankung, insbesondere HUS, in Zusammenhang stehen, zu O157, O26, O111, O103 und O145 (Literaturhinweis 1). In dieser Technischen Spezifik

33、ation wurde die folgende Nomenklatur angewendet: stx: Shiga-Toxin-Gene (gleichbedeutend mit vtx); Stx: Shiga-Toxin (gleichbedeutend mit Vtx: Verocytotoxin); STEC: Shiga-Toxin bildende Escherichia coli (gleichbedeutend mit VTEC: Verocytotoxin bildende Escherichia coli). Die Internationale Normenorgan

34、isation (ISO) weist darauf hin, dass die bereinstimmung mit diesem Dokument die Verwendung von Patenten bedeuten kann. ISO nimmt keine Stellung zur Rechtmigkeit, zur Gltigkeit und zum Anwendungsbereich dieses Patentrechts. Der Halter dieses Patentrechts hat ISO zugesichert, dass er bereit ist, ber L

35、izenzen zu vernnftigen und nicht diskriminierenden Geschftsbedingungen mit Antragstellern in der ganzen Welt zu verhandeln. In diesem Zusammenhang ist die Erklrung des Halters dieses Patentrechts bei ISO registriert. Informationen sind erhltlich bei: Agence Nationale de scurit sanitaire de lalimenta

36、tion, de lenvironnement et du travail/ French Agency for Food, Environment and Occupational Health and Safety (ANSES) 10 rue Pierre Curie F-94700 MAISONS-ALFORT Cedex France Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen, ohne dass diese vorsteh

37、end identifiziert wurden. ISO ist nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. ISO (www.iso.org/patents) unterhlt eine Online-Datenbank von Patenten, die fr ihre Dokumente relevant sind. Die Anwender werden ermutigt, diese Datenbanken zu verwenden, um be

38、r aktuellste Informationen zu Patenten auf dem Laufenden zu sein. DIN CEN ISO/TS 13136 (SPEC 10794):2013-04 CEN ISO/TS 13136:2012 (D) 5 WICHTIG Es ist notwendig, alle STEC als humanpathogen und mglicherweise schwere Erkrankungen hervorrufend zu betrachten, was sowohl vom Risikoprofil des Lebensmitte

39、ls (verzehrfertige Lebensmittel gegenber Lebensmitteln, die dafr vorgesehen sind, erst nach einer verfahrenstechnischen Behandlungen zwecks Reduzierung von vorhandenen Bakterien, wie z. B. Pasteurisieren, Kochen usw. verzehrt zu werden) als auch vom Gesundheitszustand der Person, die das Lebensmitte

40、l aufnimmt, abhngt. Auerdem ist es in Anbetracht der hohen Plastizitt der Genome dieser Bakterienarten mglich, dass aufgrund neuartiger Anordnungen von Virulenzmerkmalen neuartige Sero-Pathogruppen entstehen, wie z. B. das Shiga-Toxin bildende enteroaggregative E. coli O104, das zu den HUS-Ausbrchen

41、 in Deutschland und Frankreich im Mai/Juni 2011 fhrte. Neue atypische Sero-Pathogruppen von E. coli knnen aufgrund des Erwerbs eines stx-konvertierenden Bakteriophagen durch einen E.-coli-Stamm, der zu anderen Pathogruppen als STEC gehrt, entstehen. Derartige atypische Stmme fallen in den Anwendungs

42、bereich dieses Verfahrens und knnen effektiv nachgewiesen werden, da sie in Bezug auf das Vorliegen des stx-Gens positiv sind. 1 Anwendungsbereich Diese Technische Spezifikation beschreibt die Identifizierung von Shiga-Toxin bildenden Escherichia coli (STEC) mit Hilfe des Nachweises folgender Gene:

43、a) der wichtigsten Virulenzgene von STEC, stx und eae (Literaturhinweise 2, 3); b) der mit den Serogruppen O157, O111, O26, O103 und O145 assoziierten Gene (Literaturhinweise 3, 4). In jedem Fall, wenn eines oder beide der stx-Gene nachgewiesen wird/werden, wird versucht, den Stamm zu isolieren. Die

44、 Isolierung von STEC aus Proben, die positiv hinsichtlich der Anwesenheit von Genen solcher Serogruppen sind, die im Anwendungsbereich dieses Verfahrens liegen, kann durch die Anwendung serogruppenspezifischer Anreicherungsverfahren (z. B. immunomagnetische Separation, IMS) erleichtert werden. In de

45、m beschriebenen Verfahren wird die Real-time-PCR als das Referenzverfahren zum Nachweis der Virulenzgene und der mit bestimmten Serogruppen-assoziierten Gene angewendet. Die vorliegende Technische Spezifikation ist anwendbar auf: 1) Erzeugnisse, die fr den menschlichen Verzehr und als Futtermittel v

46、orgesehen sind; 2) Umgebungsproben im Bereich der Herstellung und Handhabung von Lebensmitteln; 3) Umgebungsproben im Bereich der Primrproduktion. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die i

47、n Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs General requirements and guidance for microbiological examinations ISO 20838, Microbiology of fo

48、od and animal feeding stuffs Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens Requirements for amplification and detection for qualitative methods ISO 22174, Microbiology of food and animal feeding stuffs Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens Ge