DIN 58932-3-2017 Haematology - Determination of the concentration of blood corpuscles in blood - Part 3 Reference method for the determination of the concentration of erythrozytes .pdf

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1、Januar 2017DEUTSCHE NORM Preisgruppe 15DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 11.100.30!%.T“2581149www.din.deDIN 58932-3Hmatologie Bestimmung der Blutkrperchenkonz

2、entration im Blut Teil 3: Referenzverfahren zur Bestimmung der Konzentration der Erythrozyten;Text Deutsch und EnglischHaematology Determination of the concentration of blood corpuscles in blood Part 3: Reference method for the determination of the concentration of erythrozytes;Text in German and En

3、glishHmatologie Dtermination de la concentration des globules dans le sang Partie 3: Procdure de rfrence pour la dtermination de la concentration des rythrocytes;Texte en allemand et anglaisAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz frDIN 58932-3:1994-04www.beuth.deGesamtum

4、fang 64 SeitenDDIN-Normenausschuss Medizin (NAMed)DIN 58932-3:2017-01 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich . 4 2 Normative Verweisungen . 4 3 Begriffe 4 4 Formelzeichen 6 5 Messgre und Einheit 7 6 Referenzverfahren 7 6.1 Anforderungen an das Erythrozytenzhlgert . 7 6.2 Vorbereitung der Refer

5、enzmessung 10 6.3 Durchfhrung der Referenzmessung . 12 6.4 Auswertung 13 6.5 Messunsicherheit . 14 6.6 Qualittskontrolle des Referenzverfahrens 15 (informativ) Erluterungen . 16 Anhang AA.1 Durchflusszytometrisches Messverfahren . 16 A.2 Ableitung der Gleichung der Regressionsgeraden 16 A.3 Ableitun

6、g des Korrekturfaktors zur Bercksichtigung von Koinzidenzverlusten . 17 (informativ) Abkrzungen . 19 Anhang BB.1 In der Durchflusszytometrie gebruchliche Abkrzungen 19 (informativ) Beispiel fr die Berechnung der Erythrozytenkonzentration 20 Anhang CC.1 Angabe der Messdaten . 20 C.2 Ausreiertest 22 C

7、.3 Auswertung durch Extrapolation auf verschwindenden Volumenanteil (i 0) . 23 C.4 Berechnung der Messunsicherheit . 26 C.5 Angabe der Ergebnisse 29 Literaturhinweise . 31 DIN 58932-3:2017-01 3 Vorwort Diese Norm wurde im Arbeitsausschuss NA 063-03-06 AA Hmatologie des DIN-Normenausschusses Medizin

8、(NAMed) erarbeitet und im Einvernehmen mit der Physikalisch-Technischen Bundesanstalt Braunschweig und Berlin herausgegeben. Der Arbeitsausschuss setzt sich zusammen aus Vertretern der medizinischen Fachgesellschaften INSTAND e. V., DGKL e. V., DGHO e. V. und Vertretern der Diagnostikindustrie. DIN

9、58932, Hmatologie Bestimmung der Blutkrperchenkonzentration im Blut besteht aus den folgenden Teilen: Teil 1: Blutentnahme, Probenvorbereitung, Einflussgren, Strfaktoren; Teil 2: Kennzeichnende Gren fr Erythrozyten (Erythrozytenindices); Teil 3: Referenzverfahren zur Bestimmung der Konzentration der

10、 Erythrozyten; Teil 4: Referenzverfahren zur Bestimmung der Konzentration der Leukozyten; Teil 5: Referenzverfahren zur Bestimmung der Konzentration der Thrombozyten. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. Das DIN und/oder die DKE si

11、nd nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. nderungen Gegenber DIN 58932-3:1994-04 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) die Auswertung wurde genauer beschrieben; b) die Ableitung der Gleichung der Regressionsgeraden wurde aufgenommen (A.2); c) d

12、ie Ableitung des Korrekturfaktors wurde detaillierter beschrieben (A.3); d) Beispiele fr die Berechnung der Erythrozytenkonzentration (Anhang C) wurden aufgenommen; e) Immunmarkierung der Erythrozyten bei Messung mit optischen Durchflusszytometern aufgenommen; f) die Norm wurde an die neuen Gestaltu

13、ngsregeln angepasst und aktualisiert. Frhere Ausgaben DIN 58932-3: 1994-04 DIN 58932-3:2017-01 4 1 Anwendungsbereich Diese Norm gilt fr die Bestimmung der Konzentration der Erythrozyten im Humanblut mit einem Referenzverfahren. Sie gilt nur fr die analytische Phase. Die Einhaltung der in dieser Norm

14、 festgelegten gerte- und messtechnischen Anforderungen bei der Durchfhrung des Referenzverfahrens stellt sicher, dass die Konzentration der Erythrozyten im Blut mit einer mglichst geringen Messunsicherheit bestimmt wird. Diese Norm gilt auch zur Partikelzhlung in stabilisierten Kontrollbluten mit fi

15、xierten humanen Blutkrperchen oder in Suspensionen mit Teilchen nicht biologischen Ursprungs (z. B. Kgelchen mit Oberflchenantigenen), wenn sich die zu messenden Partikel messtechnisch wie Erythrozyten (definiert in 3.3) verhalten. 2 Normative Verweisungen Die folgenden Dokumente, die in diesem Doku

16、ment teilweise oder als Ganzes zitiert werden, sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN 58932-1,

17、 Hmatologie Bestimmung der Blutkrperchenkonzentration im Blut Teil 1: Blutentnahme, Probenvorbereitung, Einflussgren, Strfaktoren DIN 58932-2, Hmatologie Bestimmung der Blutkrperchenkonzentration im Blut Teil 2: Kennzeichnende Gren fr Erythrozyten (Erythrozytenindices) 3 Begriffe Fr die Anwendung di

18、eses Dokuments gelten die Begriffe nach DIN 58932-1 und DIN 58932-2 und die folgenden Begriffe. 3.1 Untergrund Beitrag zum Messwert der Konzentration der Erythrozyten, verursacht durch nicht von Erythrozyten herrhrende Impulse Anmerkung 1 zum Begriff: Der Untergrund kann verursacht werden durch: a)

19、Rauschen der Detektoren (Messwertaufnehmer) und von elektronischen Baugruppen; b) Impulse, die nicht durch Partikel erzeugt werden (z. B. durch Netzteile); c) Partikel im Suspensionsmittel. Die Auswirkungen dieser Strgren werden durch die Leerwertbestimmung nachgewiesen und quantifiziert. Weitere Be

20、itrge zum Untergrund werden verursacht durch die zu untersuchende Probe, d. h. durch: d) Matrixeffekte (Partikel in der Probe, die keine Erythrozyten sind, jedoch den Erythrozyten entsprechende Messsignale verursachen, z. B. Thrombozytenagglomerate). DIN 58932-3:2017-01 5 3.2 Leerwertbestimmung Mess

21、ung unter Verwendung des Suspensionsmittels nach Zugabe aller zur Herstellung der Messsuspension erforderlichen Reagenzien, jedoch ohne Beifgung der Probe QUELLE: DIN 58932-4:2003-07, Begriff 3.4 3.3 Erythrozyten rote Blutzellen ausgereifte, kernlose Zellen im menschlichen peripheren Blut, welche fr

22、 den Sauerstofftransport Hmoglobin enthalten und Expressionen des Oberflchen-Antigens CD235a (Glycophorin A) aufweisen und bei gesunden Personen bilden Erythrozyten eine Form hnlich einer bikonkaven Scheibe aus 3.4 Erythrozytengeister rote Blutzellen, welche eine Hmolyse durchlaufen haben und deren

23、Zellmembranen sich wieder geschlossen haben und die kein Hmoglobin mehr enthalten 1 3.5 Erythrozytenzhlgert Gert zur Zhlung suspendierter Teilchen, einschlielich Blutkrperchenzhlgerten und anderer Durchflusszytometer, mit dem die Teilchen (Erythrozyten) beim Durchstrmen des sensitiven Bereiches eine

24、s Messwertaufnehmers registriert werden Anmerkung 1 zum Begriff: Die Teilchenzhlung kann auf der Messung der Impedanznderung beim Durchgang eines Teilchens durch eine kleine Messffnung, auf der Messung des an Partikeln gestreuten Lichts und auf der Messung von Fluoreszensemissionen von gefrbten Zell

25、en beruhen. Die in der Erfassungszone erzeugten aufeinanderfolgenden elektronischen Pulse werden verarbeitet und in einer geeigneten Datenerfassung aufgezeichnet. 3.6 Durchflusszytometrisches Messverfahren zur Bestimmung der Erythrozytenkonzentration Messverfahren zur Bestimmung der Konzentration vo

26、n Erythrozyten im Durchfluss aus a) der Anzahl der Erythrozyten, die whrend der Messung durch den sensitiven Bereich des Messwertaufnehmers strmen, b) dem Messvolumen, c) dem Volumenanteil der Probe in der Messsuspension, oder durch Bestimmung von d) der Erfassungsrate von Erythrozyten, welche den s

27、ensitiven Bereich des Messwertaufnehmers whrend der Messung passieren, e) der Durchflussrate des gemessenen Probenvolumens, f) dem Volumenanteil der Probe in der Messsuspension. Anmerkung 1 zum Begriff: Erluterungen siehe A.1 und Abschnitt 6. 3.7 Messvolumen Volumen der Messsuspension, die whrend de

28、r Messung durch den Messwertaufnehmer strmt QUELLE: DIN 58932-4:2003-07, Begriff 3.8 DIN 58932-3:2017-01 6 3.8 Probe ungerinnbar gemachtes Blut humanen Ursprungs Anmerkung 1 zum Begriff: Als Antikoagulanz ist EDTA zu bevorzugen. QUELLE: DIN 58932-5:2007-10, Begriff 3.6 3.9 Messsuspension die auf ein

29、en bestimmten Volumenanteil verdnnte Probe QUELLE: DIN 58932-4:2003-07, Begriff 3.7 4 Formelzeichen Formelzeichen Bedeutung Einheit a Ordinatenabschnitt der Regressionsgeraden 1 b Steigung der Regressionsgeraden 1 C Konzentration der Erythrozyten in der Probe L1C0Festgelegte Erythrozytenkonzentratio

30、n, bei der die relative erweiterte Messunsicherheit k ureleinen geforderten Wert nicht berschreiten df L1Cri,jRegistrierte oder nach Gleichung (2) berechnete Konzentration der Erythrozyten in der Messsuspension i bei der Wiederholungsmessung j L1riber alle Wiederholungsmessungen j gemittelte registr

31、ierte oder nach Gleichung (2) berechnete Konzentration der Erythrozyten in der Messsuspension i L1Ci,jKonzentration der Erythrozyten in der Messsuspension i, bei der Wiederholungsmessung j (abgeleitet von der registrierten Konzentration Cri,jdurch Korrektur der Koinzidenzverluste) L1iber alle Wieder

32、holungsmessungen j gemittelte Konzentration der Erythrozyten in der Messsuspension i L1k Erweiterungsfaktor zur Bestimmung der erweiterten Messunsicherheit = 1 N Anzahl der Erythrozyten in der Probe mit dem Volumen V 1 Nri,jAnzahl der bei der Wiederholungsmessung j registrierten Erythrozyten in eine

33、m Volumen Vi,jder Messsuspension i 1 riber alle Wiederholungsmessungen j gemittelte Anzahl der registrierten Erythrozyten in einem Volumen V der Messsuspension i 1 Ni,jAnzahl der Erythrozyten in dem Volumen Vi,jder Messsuspension i, Wiederholungsmessung j 1 ri,jtotalGesamtanzahl aller bei der Wieder

34、holungsmessung j registrierten Ereignisse in einem Volumen Vi,jder Messsuspension i 1 n Anzahl der Wiederholungsmessungen, Stichprobenumfang 1 p Koinzidenzparameter 1 DIN 58932-3:2017-01 7 Formelzeichen Bedeutung Einheit SiStandardabweichung der Gre ri1 SxFr die Messunsicherheitsanalyse bentigte Sum

35、me ber die Werte x 1 Sx2Fr die Messunsicherheitsanalyse bentigte Summe ber die Quadrate der Werte x 1 SxyFr die Messunsicherheitsanalyse bentigte Summe ber die Produkte xy 1 SyFr die Messunsicherheitsanalyse bentigte Summe ber die Werte y 1 TkritKritischer Wert beim Ausreiertest 1 ti,jMesszeit der M

36、esssuspension i, Wiederholungsmessung j s u Standardmessunsicherheit Einheit der jeweiligen Messgre urelRelative Standardmessunsicherheit 1 V Volumen der Probe L Vi,jVolumen der Messsuspension i, Wiederholungsmessung j L iber alle Wiederholungsmessungen j gemitteltes Volumen Vi,jder Messsuspension i

37、 L Impulsauflsungszeit, Totzeit s iVolumenanteil der Probe in der Messsuspension i 1 5 Messgre und Einheit Die Messgre ist die Erythrozytenkonzentration in der Probe. Die Einheit der Messgre ist die auf die Probe bezogene reziproke Volumeneinheit L1oder deren dezimale Teile. 6 Referenzverfahren 6.1

38、Anforderungen an das Erythrozytenzhlgert Als Referenzgert kann jedes nach dem durchflusszytometrischen Messverfahren arbeitende Zellzhlgert verwendet werden, sofern es ber einen geeigneten Messwertaufnehmer verfgt und die Unterscheidung der Erythrozyten von anderen Zellpopulationen und Partikeln erl

39、aubt. Die Erythrozytenkonzentration ist definiert als der Quotient aus Erythrozytenanzahl und dem Volumen: =(1) Das Gert muss so beschaffen und mit Zusatzeinrichtungen ausgestattet sein, dass die in Gleichung (2) vorkommenden Gren zur Berechnung der Partikelkonzentration ri,j=ri,ji,j i(2) DIN 58932-

40、3:2017-01 8 mit den nachfolgenden angegebenen erweiterten Messunsicherheiten k u einzeln bestimmt werden knnen. Fr eine hinreichend hohe Anzahl an Wiederholungsmessungen und dem Vorliegen einer Normalverteilung betrgt k 2 und die erweiterte Messunsicherheit 2 u entspricht einem Vertrauensniveau von

41、ca. 95 % 2. Die in Gleichung (1) und (2) vorkommenden Gren sind wie folgt definiert: Vi,jVolumen der Messsuspension i, die whrend der Messung j durch den sensitiven Bereich des Messwert-aufnehmers strmt. Dieses Volumen und damit das Volumen V mssen mit einer relativen erweiterten Messunsicherheit vo

42、n rel () 0,6% bestimmt werden. iVolumenanteil der Probe in der Messsuspension i. Der Volumenanteil muss mit einer relativen Messunsicherheit rel (i) 0,6 % bestimmt sein. Die Verdnnungen mssen gravimetrisch hergestellt und die Dichten von Probe, Verdnnungsmedium und anderen genutzten Reagenzien mssen

43、 gemessen und bercksichtigt werden. Nri,jAnzahl der registrierten Ereignisse - von Erythrozyten verursacht - in dem untersuchten Volumen der Messsuspension Vi,jmit einem Volumenanteil der Probe in der Messsuspension von i. Cri,jregistrierte Konzentration, entsprechend der Gleichung (2) aus der Anzah

44、l der registrierten Ereignisse Ni,jbestimmt. Der Index r bercksichtigt die Tatsache, dass die Konzentration aus dem gemessenen Volumen und der Anzahl der registrierten Ereignisse direkt bestimmt werden kann. N die im Volumen V der Probe enthaltene Anzahl von Erythrozyten. N muss mit Hilfe der Method

45、e der definierten Verdnnungsreihe zur Korrektur koinzidenzbedingter Zhlverluste mit einer relativen erweiterten Messunsicherheit rel () 1,5 % (siehe 6.2 bis 6.6) bestimmt sein. Die Berechnung von N erfolgt aus der bezglich des Untergrundes korrigierten Anzahl der registrierten Impulse Nri,j. Kann di

46、e automatische Koinzidenzkorrektur nicht ausgeschaltet werden, mssen die vom Messwertaufnehmer aufgenommenen, verstrkten Primrsignale verwendet werden. Elektronische Totzeiten (Zeitkonstanten, Impulsbewertungszeiten) mssen vernachlssigbar klein gegen die Impulsauflsungszeit der verstrkten Detektorim

47、pulse sein. ANMERKUNG 1 Die Wiederholungsmessungen bei einer Verdnnung (d. h. Messsuspension) i werden durch den Index j gekennzeichnet; die Anzahl der registrierten Ereignisse ist Nri,jund das Volumen Vi,j. ANMERKUNG 2 Die registrierte oder nach (2) berechnete Teilchenkonzentration Cri,jist wegen d

48、er Koinzidenzverluste geringer als die Teilchenkonzentration i C in der Messsuspension. Fr den Fall, dass zur Erhhung der Spezifitt der Erythrozytenidentifizierung Fluoreszenzmarkierungen eingesetzt werden, muss das Erythrozytenzhlgert fr jedes verwendete fluoreszenzmarkierte Antigen ber einen entsprechenden Detektionskanal verfgen. Es wird fr optische Teilchendetektion empfohlen, simultan zur Fluoreszenzdetektion zustzlich die Intensitt des gestreuten Lichts in Vorwrts- und Seitwrtsrichtung zu erfassen. Die durch Zugabe von Frbereagenzien zustzlich auftretenden Messunsiche