DIN 10186-2005 Microbiological analysis of milk - Enumeration of yeasts and moulds - Reference method《牛奶的微生物分析 酵母和霉菌的计数 参照法》.pdf

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1、Oktober 2005DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 8DIN Deutsches Institut f r Normung e.V. Jede Art der Vervielf ltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut f r Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 07.100.30

2、; 67.100.10FM 9647104www.din.deXDIN 10186Mikrobiologische Milchuntersuchung Bestimmung der Anzahl von Hefen und Schimmelpilzen ReferenzverfahrenMicrobiological analysis of milk Enumeration of yeasts and moulds Reference methodAnalyse microbiologique du lait Dnombrement des levures et des moisissures

3、 Mthode de rfrenceAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz f rDIN 10186:199111www.beuth.deGesamtumfang 8 SeitenDIN 10186:2005-10 2 Vorwort Diese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte, Arbeits-ausschuss Mikrobiologische Milchuntersuch

4、ung“ erarbeitet. nderungen Gegenber DIN 10186:1991-11 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) Abschnitt Aufschmelzen und Ansuern des Nhrbodens“ in den Abschnitt Herstellung des Nhrbodens“ berfhrt; b) Verweisungen aktualisiert; c) Norm redaktionell den derzeit gltigen Gestaltungsregeln angepasst. F

5、rhere Ausgaben DIN 10186: 1983-10, 1991-11 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt ein Referenzverfahren zur Bestimmung der Anzahl von Hefen und Schimmelpilzen fest. Das Verfahren gilt fr Milch und Milchprodukte sowie fr Suglings- und Kleinkindernahrung auf Milchbasis. 2 Normative Verweisungen Die folge

6、nden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN EN ISO 707, Milch und Milchpro

7、dukte Leitfaden zur Probenahme DIN EN ISO 8261, Milch und Milchprodukte Allgemeiner Leitfaden fr die Vorbereitung von Untersuchungsproben und die Herstellung von Anschttelungen und Dezimalverdnnungen fr mikrobiologische Untersuchungen 3 Begriffe Fr die Anwendung dieser Norm gilt der folgende Begriff

8、. 3.1 Anzahl von Hefen und Schimmelpilzen Anzahl koloniebildender Einheiten, die unter den in dieser Norm festgelegten Bedingungen makroskopisch zhlbare Kolonien bilden DIN 10186:2005-10 3 4 Kurzbeschreibung Von der flssigen oder in flssigen Zustand versetzten Untersuchungsprobe werden dezimale Verd

9、nnungen hergestellt. Jeweils 1 ml der Verdnnungsstufen wird in Petrischalen mit dem Nhrboden vermischt und vier Tage bei 25 C bebrtet. Die Kolonien werden gezhlt (Koloniezahl) und auf die Anzahl der Einheiten koloniebildender Hefen und Schimmelpilze je Milliliter oder Gramm der Probe umgerechnet. 5

10、Nhrboden und Chemikalien 5.1 Allgemeines Chemikalien und Nhrbodenbestandteile mssen fr mikrobiologische Zwecke geeignet sein. Trockennhrbden mssen nach der Anweisung des Herstellers zubereitet werden und den Festlegungen dieser Norm entsprechen. Das verwendete Wasser muss entweder in Glasgerten dest

11、illiert oder entmineralisiert und von entsprechender Reinheit sein. Es darf keine Bestandteile enthalten, die das Wachstum von Mikroorganismen beeinflussen. 5.2 Hefeextrakt-Glucose-Chloramphenicol-Agar 5.2.1 Zusammensetzung 5 g Hefeextrakt 20 g Glucose 0,1 g Chloramphenicol 12 g bis 15 g Agar (je na

12、ch Geliereigenschaft) 1 000 ml Wasser 5.2.2 Herstellung des Nhrbodens Die einzelnen Bestandteile werden durch Erhitzen und Schtteln vollstndig in Wasser gelst. Der Nhrboden wird 15 min bei (121 1) C sterilisiert, sollte bei 24 C einen pH-Wert von 6,6 0,2 aufweisen und im Dunkeln bei 4 C bis 6 C nich

13、t lnger als 3 Monate aufbewahrt werden. Der Nhrboden wird vor Beginn der Untersuchung vollstndig geschmolzen und anschlieend im Wasserbad auf (47 2) C abgekhlt. Im Fall einer Untersuchung von nicht fermentierten Produkten kann zu diesem Nhrboden sterile Weinsure mit 10 % Massenanteil (5.4) zugegeben

14、 werden, sodass ein pH-Wert von 4,6 0,2 erhalten wird. Dieser Nhrboden muss innerhalb von einer Stunde verarbeitet werden. Ein wiederholtes Schmelzen des Nhrbodens zum Zwecke der Wiederverwendung ist nicht zulssig. 5.3 Verdnnungsflssigkeit Als Verdnnungsflssigkeit wird Kochsalz-Pepton-Lsung oder vie

15、rtelstarke Ringer-Lsung nach DIN EN ISO 8261 verwendet. Die Verwendung anderer Verdnnungsflssigkeiten muss im Unter-suchungsbericht angegeben werden. DIN 10186:2005-10 4 5.4 Weinsure, sterilisiert, Massenanteil w = 10 % 6 Gerte und Hilfsmittel 6.1 Allgemeines Alle Glasgerte mssen vor der Verwendung

16、sorgfltig gereinigt und sterilisiert werden. Kunststoffgerte mssen steril sein. Mechanische Pipetten und andere Gerte fr die mechanisierte und automatisierte Durchfhrung der Arbeitsgnge drfen verwendet werden, sofern durch entsprechende Untersuchungen sichergestellt ist, dass vergleichbare Ergebniss

17、e erzielt werden. 6.2 Dampf-Sterilisator (Autoklav), einstellbar auf (121 1) C, z. B. Dampf-Sterilisator nach DIN EN 285. 6.3 Dampftopf 6.4 Heiluftsterilisator, einstellbar auf mindestens 180 C. 6.5 Brutschrank, einstellbar auf (25 1) C, z. B. Brutschrank nach DIN 58945-1. 6.6 pH-Messeinrichtung mit

18、 Temperaturkompensation. 6.7 Wasserbad, einstellbar auf (47 2) C. 6.8 Lupe, 2fache bis 4fache Vergrerung. 6.9 Lupe, mindestens 8fache Vergrerung. 6.10 Mikroskop, mindestens 400fache Vergrerung. 6.11 Kulturrhrchen, etwa 150 mm Lnge, etwa 15 mm Durchmesser, oder Flaschen mit einem Nennvolumen von 150

19、ml bis 250 ml, ausgestattet mit geeignetem Stopfen oder Verschluss. 6.12 Pipetten 6.13 Petrischalen, Durchmesser etwa 90 mm, z. B. nach DIN 12339. Um eine bessere Zhlbarkeit der Kolonien zu erzielen, drfen auch Petrischalen mit einem Durchmesser von etwa 145 mm verwendet werden. 7 Probenahme Nach DI

20、N EN ISO 707. 8 Durchfhrung 8.1 Allgemeines Die in den 8.2 bis 8.5 festgelegten Arbeitsgnge drfen nicht unter direkter Sonneneinstrahlung durchgefhrt werden. DIN 10186:2005-10 5 8.2 Vorbereitung der Untersuchungsprobe (Anschttelung) Je nach Art der Untersuchungsprobe nach DIN EN ISO 8261. blicherwei

21、se werden 10 g oder 10 ml der Untersuchungsprobe mit der 9fachen Menge Verdnnungsflssigkeit vermischt. 8.3 Herstellen der Verdnnungen Die Verdnnungsstufen werden so gewhlt, dass Petrischalen mit Kolonieanzahlen von 10 bis 200 erwartet werden knnen. Mindestens 1 ml der nach 8.2 vorbereiteten Untersuc

22、hungsprobe wird zu der 9fachen Menge Verdnnungsflssigkeit hinzugefgt. 1 ml dieser Verdnnung entspricht 0,01 g bzw. 0,01 ml der Untersuchungsprobe. Hhere Verdnnungsstufen werden jeweils durch Hinzufgen von mindestens 1 ml der vorhandenen Verdnnung zu der 9fachen Menge Verdnnungsflssigkeit hergestellt

23、. Fr jede Verdnnungsstufe ist eine andere Pipette zu verwenden. Die Verdnnungsgefe werden jeweils unmittelbar vor der weiteren Verarbeitung geschttelt. 8.4 Beimpfung Mit einer sterilen Pipette werden jeweils zwei Petrischalen mit je 1 ml der Untersuchungsprobe, Anschttelung oder der entsprechenden V

24、erdnnungsstufe beschickt. Fr jede Verdnnungsstufe wird eine andere Pipette verwendet. Anschlieend werden 10 ml (bei Petrischalen mit 145 mm Durchmesser 25 ml) des geschmolzenen und auf (47 2) C abgekhlten Nhrbodens in die beschickten Petrischalen bergefhrt. Unmittelbar danach wird die Untersuchungsp

25、robe, Anschttelung oder Verdnnung mit dem Nhrboden vermischt, sodass eine gleichmige Verteilung erreicht wird. Die Petrischalen werden auf einer nivellierten Flche stehen gelassen, bis der Nhrboden verfestigt ist. Zwischen dem Herstellen der Verdnnungen und dem Ausgieen des Nhrbodens drfen nicht meh

26、r als 15 min vergehen. 8.5 Bebrten Die Bebrtungstemperatur betrgt (25 1) C, die Bebrtungsdauer (96 4) h. Die Petrischalen mssen mit dem Deckel nach unten in den Brutschrank gelegt werden. Wenn groe Kolonien erwartet werden, sollten die Petrischalen nach drei Tagen berprft und gegebenenfalls anschlie

27、end ausgezhlt werden. Diese Abweichung ist im Untersuchungsbericht anzugeben. 9 Auswertung 9.1 Zhlen der Kolonien Die Kolonien werden unmittelbar nach dem Bebrten ausgezhlt und, falls erforderlich, werden dabei die Hefekolonien von den Schimmelpilzkolonien morphologisch unterschieden. ANMERKUNG Fall

28、s ein Auszhlen unmittelbar nach dem Bebrten nicht mglich ist, drfen die bebrteten Petrischalen bei 2 C bis 4 C bis zwei Tage aufbewahrt werden. Die Kolonien werden in diffusem Licht gezhlt. Um das Zhlen zu erleichtern, darf eine Lupe nach 6.8 verwendet werden. In Zweifelsfllen ist mit einer strkeren

29、 Lupe nach 6.9 die Unterscheidung zwischen Kolonien und anderen Partikeln abzusichern. Falls erforderlich ist mikroskopisch zu prfen, ob es sich um Schimmelpilze bzw. Hefen handelt. DIN 10186:2005-10 6 9.2 Berechnung der Anzahl von Hefen und Schimmelpilzen 9.2.1 Grundstzlich sind solche Petrischalen

30、 auszuwerten, die 10 Kolonien bis 200 Kolonien aufweisen. 9.2.2 Die Anzahl von Hefen und Schimmelpilzen wird anhand des gewichteten arithmetischen Mittels bestimmt, d. h. die Summe aller ausgezhlten Kolonien wird dividiert durch die Summe der untersuchten Substratmengen. Die Anzahl der Mikroorganism

31、en je Milliliter bzw. Gramm wird nach Gleichung (1) berechnet: dnncc +=1,0121(1) Dabei ist c die Anzahl der koloniebildenden Einheiten je Milliliter bzw. Gramm; c die Summe der Kolonien aller Petrischalen, die nach 9.2.1 zur Berechnung herangezogen werden; n1die Anzahl der Petrischalen der niedrigst

32、en Verdnnungsstufe, die zur Berechnung herangezogen werden (n1= 2 bei zwei Petrischalen); n2die Anzahl der Petrischalen der nchsthheren Verdnnungsstufe, die zur Berechnung herangezogen werden; d der Faktor der niedrigsten ausgewerteten Verdnnungsstufe; hierbei handelt es sich um die auf n1bezogene V

33、erdnnungsstufe. BEISPIEL fr die Berechnung Anzahl der Kolonien auf zwei Petrischalen der Verdnnungsstufe 10-3: 133 und 115 Anzahl der Kolonien auf zwei Petrischalen der Verdnnungsstufe 10-4: 15 und 10 gbzw.mljeEinheitendendekoloniebil000 124101,02122733=+=cc9.2.3 Fr die Angabe des nach 9.2.2 ermitte

34、lten Ergebnisses sind lediglich zwei Stellen heranzuziehen. Die dritte Stelle wird auf 0 gerundet. Betrgt diese 5, wird abgerundet, wenn die ersten beiden Stellen eine gerade Zahl ergeben, und aufgerundet, wenn die ersten beiden Stellen eine ungerade Zahl ergeben: BEISPIELE 124 120 125 120 135 140 9

35、.2.4 Werden auf den Petrischalen nur Kolonieanzahlen unter 10 gefunden, wird die Anzahl der Hefen und Schimmelpilze mit weniger als 10 d “ angegeben, wobei d der Faktor der niedrigsten Verdnnungs-stufe ist. DIN 10186:2005-10 7 9.2.5 Wenn nur Kolonieanzahlen ber 200 gefunden werden und falls die Kolo

36、nien noch einzeln zhlbar sind, wird das Ergebnis als geschtzte Anzahl“ von Hefen und Schimmelpilzen je Milliliter bzw. Gramm multipliziert mit dem Verdnnungsfaktor d angegeben. 9.2.6 Das Ergebnis darf auch als Zahl zwischen 1,0 und 9,9, multipliziert mit 10x, angegeben werden, wobei x die entspreche

37、nde Zehnerpotenz bedeutet. BEISPIEL 1,2 105je ml bzw. g. 10 Untersuchungsbericht Im Untersuchungsbericht sind mindestens anzugeben: a) Hinweis auf diese Norm; b) Art, Herkunft und Bezeichnung der Untersuchungsprobe; c) Art und Datum der Probenahme; d) Eingangs- und Untersuchungsdatum; e) Anzahl von

38、Hefen und Schimmelpilzen je Milliliter oder Gramm der Untersuchungsprobe; f) Angabe, wenn nach 8.5 nach drei Tagen die Bebrtung abgebrochen wird; g) gegebenenfalls Abweichungen von den Festlegungen dieser Norm. DIN 10186:2005-10 8 Literaturhinweise DIN 12339, Laborgerte aus Glas Petrischalen DIN 58945-1, Brutschrnke fr mikrobiologische Zwecke Begriffe, Anforderungen, Anwendung DIN EN 285, Sterilisation Dampf-Sterilisatoren Gro-Sterilisatoren