现代分子生物学_课件(3)生物信息的传递(上).ppt

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1、第三章 生物信息的传递（上） 从DNA到RNA,以基因的形式荷载遗传信息，是生命遗传的物质基础。DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存（DNA 复制）。 作为基因复制和转录的模板，是个体生命活动的信息基础。DNA的生物学功能是以蛋白质的形式表达出来的。通过转录生成信使RNA，翻译生成蛋白质的过程来控制生物个体性状（基因表达）。,DNA的基本功能：,基因表达(gene expression)：是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子。,一、基本概念,生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。,转录(transcription)

2、：,转录是生物界RNA合成的主要方式，是遗传信息从DNA向RNA传递过程，也是基因表达的开始。,第一节 转录的基本原理,参与转录的物质,模板:DNA 酶: RNA聚合酶 原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 其他蛋白质因子,RNA合成方向：5 3,转录模板,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。 一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列为一个转录单元。 DNA双链按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作反意义链或Waston链。 相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也称为有意义链或Cric

3、k链。,5G C A G T A C A T G T C3 3 c g t c a t g t a c a g5,5G C A G U A C A U G U C3,N Ala Val His Val C,DNA,转录,mRNA,翻译,肽,DNA模板、转录产物mRNA和氨基酸序列之间的关系,编码链,模板链,不对称转录(asymmetric transcription),在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录 ； 模板链并非永远在同一条单链上。,转录与复制的相似之处： 都是酶促的核苷酸聚合过程； 都以DNA为模板； 都需依赖DNA的聚合酶； 聚合过程都是核苷酸之间生成

4、磷酸二酯键； 都从5至3 方向延伸成新链多聚核苷酸； 都遵从碱基配对规律但转录忠实性要低于DNA复制。 转录与复制都受到严格的调控,二、转录与复制的异同,转录和复制的区别,引物 有 无 高度进行性 中途不停止 可一段一段复制,（一）原核生物RNA 聚合酶,RNA聚合酶（大肠杆菌为例）,全酶=核心酶+ 因子,第二节 DNA指导下的RNA聚合酶,大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,RNA聚合酶,(二） 真核生物RNA聚合酶,真核生物的RNA聚合酶,定 位 核 仁 核 质 核 质 转录产物 45s-rRNA hnRNA 5s-rRNA,tRNA,U1-13snRNA

5、U6snRNA，（U6除外） 非UsnRNA 对鹅膏蕈碱反应 耐受 极敏感 中度敏感,RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别,第 三 节 与转录起始和终止有关的DNA结构,一、原核生物的启动子和终止子,启动子定义：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,（一）启动子结构,转录单元, RNA聚合酶保护法分析启动子结构,Pribnow,41-44bp,开始转录,T T G A C A A A C T G T,-35 区,(Pribnow box) 酶的紧密

6、结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）,T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,(Sextama box) 提供了RNA聚合酶全酶识别的信号,大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区序列分析,T85T83G81A61C69A52,T89A89T50A65A100,Pribnow 框,Sextama 框,1、Pribnow 框：,10区，保守序列为 TATAAT。 Pribnow 框是RNA聚合酶的牢固结合位点，,的存在保证原核生物RNA聚合酶只能与启动子区而不是其它区域形成稳定的二元复合物。,2、Sextama 框：,35区，保守序列为T

7、TGACA。 Sextama 框是RNA聚合酶中 的识别位点，也是RNA聚合酶的初始结合位点。,Pribnow 框与Sextama 框之间的碱基序列并不重要，但两个序列之间的距离十分重要；天然启动子这段距离多为1520bp，距离的大小可能是决定启动子强度的因素之一。实验表明：两个序列之间的距离为17bp时，转录效率最高。,3、CAP位点：（乳糖操纵子的启动子序列）,CAP即分解代谢物基因激活蛋白 (catabolite gene activation Protein)也称环腺苷酸受体蛋白（CRP）。,CAP分子内有两个结构域： 羧基末端结构域是DNA结合区； 氨基末端结构域是cAMP结合位点。

8、CAP与cAMP的结合能提高CAP对双链DNA的亲和力；CAP与启动子（CAP位点）的结合是激活乳糖操纵子转录的必要条件。,乳糖启动子中有两个CAP结合位点：一个在 70 50位点，称位点；一个在 50 40位点，称位点。,位点包含一个反向重复序列，是强结合位点；位点是弱结合位点。,典型启动子的结构,-35 -10 转录起点TTGACA 16-19bp TATAAT 5-9bp,（二）终止子结构,提供转录终止信号的序列称为终止子（terminator）;终止信号存在于RNA聚合酶已经转录过的序列之中。,原核生物终止子分为两类：一类是不依赖于因子的转录终止；一类是依赖因子的转录终止；,两类终止子

9、有共同的序列特征：在转录终止点之前有一段间断的回文结构。,两类终止子碱基组成的不同点：不依赖因子 回文结构富含G-C 下游富含A-T依赖因子 G-C含量较少 下游无特征,转录方向,3,3,5,TCGGGCG AGCCCGC,CGCCCGA GCGGGCT,AAAAAA TTT TTT,3,3,5,5,DNA,模板链,编码链,AAAAAA UUUUUU,5,TTTTTT,DNA,模板链,编码链,转录产物,3,不依赖因子 的终止子,转录方向,3,3,5,TAAGTAG ATTCATC,CTACTTA GATGAAT,AGCTAC TCGATG,3,3,5,5,DNA,模板链,编码链,AGCTAC

10、UCGAUG,5,TCGATG,DNA,模板链,编码链,转录产物,3,依赖因子 的终止子,类启动子分两部分：40 5 称为近启动子，决定转录起始的位点；16540 称为远启动子，影响转录的频率。,（一）RNA聚合酶的启动子,即 rRNA 基因的启动子，称类启动子。,二、真核生物的启动子和终止子,真核有三种不同的启动子和有关的元件 启动子最为复杂，它和原核的启动子有很多不同,（二）RNA聚合酶的启动子,1、帽子位点（cap site）： 即转录起始位点，其碱基大多为 A 。,2、TATA 框：又称Hogness 框，位于25 附近，由含有TATA 的67个核苷酸组成，保守序列为 TATA（A/T

11、）A（A/T） 。但TATA框的两侧富含G-C碱基对。,即 mRNA基因的启动子，称类启动子,核心启动子元件作用：选择正确的转录起始位点，保证精确起始。其序列的完整与准确对维持启动子的功能是必需的。,3、CAAT 框：,位于 75 附近，保守序列为 GGNCAATCT。头两个 G 非常重要，一但突变，转录效率大大下降。,4、GC 框：,位于110附近，以5 CCGCC 3序列为特征。,上游启动子元件作用： 控制着转录起始的频率。,5、增强子（enhancer）：,能结合反式作用因子，决定基因的时间和空间特异性表达，增强启动子转录活性的DNA序列。,增强子作用特点： 增强效应十分明显：使转录频率

12、增加百倍或千倍。 增强效应与其所处的位置和取向无关：增强子以53或 35排列对启动子都有作用。 大多为重复序列：长约50bp，适合与反式因子结合，内部常有一个核心序列，为增强效应所必需。 增强效应具有严密的组织和细胞特异性。 没有基因专一性。 许多增强子受外部信号的调控。,（三）RNA聚合酶 的启动子,即 tRNA基因的启动子，称类启动子。,类启动子位于转录起始点下游，称下游启动子或内部启动子。,类启动子包括：A盒、B盒 A盒靠近5方向； B盒 靠近3 方向 。,类启动子需要的转录因子包括： TF C、TF B、TF A，前两者是共同 的，后者为5S rRNA基因转录所需。,三、原核生物和真核

13、生物转录起始位点的结构差异,图5-4 P155页,原核生物与真核生物启动子比较,原核生物和真核生物转录及抑制剂,第 四 节,原核生物转录的起始原核生物转录的延长原核生物转录的终止与新合成RNA链的释放 真核生物的转录RNA生物合成抑制剂,转录起始需解决两个问题： DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。 RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。,一、原核生物转录的起始,4. 当三元复合物中RNA长69个核苷酸时，因子从全酶解离下来，进入延长阶段。,2. RNA聚合酶向10区转移，并与之牢固结合。10区DNA双链解开1217bp，形成开放的二 元启动子复合物（模板酶）。,转录起始过

14、程,1. 因子辨认转录起始点（-35区的TTGACA序列） ，RNA聚合酶全酶(2)与模板35序列结合，形成闭合的二元闭合启动子复合物。,3. 在RNA聚合酶亚基催化下形成第一个磷酸二酯键，形成三元复合物（模板酶RNA）。转录复合物： RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3,二、原核生物转录的延长,1. 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2. 在核心酶作用下，以模板链作指导，按照碱基配对原则：A-U，T-A，G-C；NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi,延长中的转录复合

15、物也叫转录空泡。随着RNA聚合酶前移，转录产物RNA不断移出转录空泡，已转录完毕的DNA双链又重新复合而不再打开。 原核生物的转录和翻译偶联进行。,转录空泡(transcription bubble)：,RNA-pol （核心酶） DNA RNA,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,三、原核生物转录的终止和新生RNA链的释放,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类：,不依赖Rho ()因子的转录终止 依赖Rho ()因子的转录终止,（一） 依赖 因子的转录终止,1969年，Roberts发现了能控制

16、转录终止的蛋白质，即因子。由相同的6个亚基组成六聚体，分子量200kD。,因子具有NTP酶活性和解螺旋酶活性，是促使转录三元复合物解离的根本原因。 因子的NTP酶活性依赖于单链RNA的结构。,因子依赖性终止子含有一个反向重复序列，使 RNA末端形成一个发夹结构，导致转录延宕，因子得以发挥作用，终止转录。,水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。,（二） 非依赖 因子的转录终止,DNA模板接近转录终止的区域内，有较密集的A-T配对区或G-C配对区，且G-C配对为回文结构。转录产物RNA的3-末端有若干个连续的U。连续U区的5-端前方碱基形成茎环结构或发夹结构。

17、这种二级结构是阻止转录继续向下游推进的关键。,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；密集A-U 配对使转录复合物趋于解离，释放RNA。终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关。,四、真核生物的转录,（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化。转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，而需依靠众多的转录因子，与模板结合形成转录起始前复合物，其起始过程比原核生物复杂得多。,真核生物RNA聚合酶II所形成的转录起始复合物,转录因子 转录复合体 TBPTAFsTFIIATFIIB TFIIFPol IITFIIE 、, 真核生物转录起始复合物,PIC组装完成，TFH使

18、CTD磷酸化,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,（三）转录终止,1、RNA聚合酶转录出rRNA前体3末端后，继续向下游转录超过1000个bp时，存在一个18bp的终止序列。2、RNA聚合酶 转录模板的下游存在一个终止子，是位于GC丰富序列之中的TTTT。RNA聚合酶有内原性的转录终止功能。3、RNA聚合酶的转录没有明确的终止信号。,五、RNA生物合成抑制剂

19、,概念：能阻断、抑制或者干扰核酸的代谢 过程，最终抑制转录的一类化合物，称RNA生物合成抑制剂。,分三类：1、嘌呤和嘧啶类似物，抑制核酸前体的合成；2、通过与DNA结合而改变模板的功能；3、与RNA聚合酶结合而影响其活力。,（一）利福霉素及利福平,作用：抗结核药物，特异地抑制细菌RNA聚合酶的活性，因而抑制细菌RNA的合成。,机制：利福霉素可与RNA聚合酶的亚基结合，并阻止起始位点的填充，抑制二核苷酸RNA的形成；利福平则阻止RNA聚合酶的移动，抑制头三个核苷酸的形成。因此，利福霉素和利福平都是RNA链合成起始过程的抑制剂。,（二）利迪链菌素,作用：与细菌的RNA聚合酶亚基结合，抑制转录过程中

20、RNA链的延长反应。,转录后加工过程及其机制,第五节,mRNA的前体加工rRNA的前体加工tRNA的前体加工, 真核细胞每种转录产物都是各种RNA的前身，即无活性，亦无功能。 真核初级转录产物必须在胞核内经过适当加工，使之变成具有活性的成熟RNA后，由胞核运至胞质才能执行翻译功能。 真核细胞转录作用和翻译作用无论在空间上还是时间上都是彼此分开进行的。 原核细胞mRNA不需加工，tRNA和rRNA加工。,真核细胞与原核细胞转录产物的区别：,一、mRNA的前体加工,1、 5端形成 帽子结构(m7GpppNp ) 2、3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail) 3、中部剪接除去内含子 4、链内

21、部核苷酸的甲基化,hnRNA转变成mRNA的加工过程包括：, 修饰的化学反应：, 5-端的修饰在核内完成，且在转录到20个核苷酸时在转鸟嘌呤核苷酸酶催化下加到5端的。先于中段剪切。, 5帽子分Cap0、Cap1、Cap2。,（一）5-端加上帽子结构(mGpppNp）,真核生物mRNA的5末端的第一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5端的这种结构称为帽子（cap）。,由稀有的7-甲基鸟嘌呤通过5,5三磷酸键与初始转录物的起始（ 5 ）核苷酸连接形成的。,转鸟嘌呤核苷酸酶催化,尿苷酸-7甲基转移酶,2-O-甲基转移酶,（cap1）,（cap0）,（cap2）,2-O-甲基转

22、移酶,mRNA帽子的生理功能：, 帽子结构参与翻译起始，帽0结构是核糖体小亚基识别mRNA所必需的；核糖体上有帽结合蛋白。, m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5末端，以保护mRNA免受5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。,（二）3-端加上多聚腺苷酸尾巴(polyA)。, polyA的出现不依赖DNA模板。 加尾信号：3-末端出现AAUAAA及下游的GU丰富区。在两序列之间由特异的核酸内切酶切除多余的核苷酸，然后加上poly A。尾部修饰和转录终止同时进行。 3-端修饰也在核内完成，并先于mRNA中段的剪接。 polyA的有无及长短是维持mRNA作为翻译模板的活性，以及增加mRNA本身

23、稳定性的因素。,约20NT,第一步：CPSF识别AAUAA信号，CstF结合GU/U区，激活CF核酸酶，发生断裂,CPSF:断裂识别因子,CstF:断裂刺激因子,第二步：PAP结合到断裂点，聚合约个腺苷酸的poly（A）尾巴，这个短的尾巴通过寡聚腺苷酸结合蛋白刺激PAP活性再进一步延伸到大约200个腺苷酸。,聚腺苷酸聚合酶（PAP）,mRNA3-端的多聚腺苷酸化可被冬虫夏草素（ 3-脱氧胸苷）所阻止；即冬虫夏草素是多聚腺苷酸化的特异抑制剂。,（三）mRNA的甲基化,真核生物mRNA分子中有许多甲基化的碱基，主要是：N6-甲基腺嘌呤（m6A）。,（四) mRNA的自我剪接,自我剪接的概念, 除去

24、hnRNA中的内含子，将外显子连接。,snRNP与hnRNA结合成为剪接体，进行剪接； 参与mRNA剪切的snRNP包括U1、U2 、U4 、U5 、U6,内含子上有3个保守性序列剪接位点： 5端起始序列GU； 3端AG; 距3端1840个核苷酸处有一个“分支点” ，一定含A， 由A发动第一次转酯反应。剪接过程是两次转脂反应。与类内含子相似。,5AAGUAAGU .CURAY(10-40)(U/C)11NCAG G.3,Intron,exon,exon,Polyprimidine,CAG = UAG AAG GAG, GU-AG、AU-AC：真核生物细胞核mRNA基因 类内含子：线粒体、叶绿体

25、及低等真核生物细胞核的rRNA基因 类内含子：线粒体、叶绿体的mRNA基因,生物体内内含子的主要类型：,类内含子的自我剪接,类内含子的自我剪接,组成型剪接：一个基因的转录产物通过剪接只能产生一种成熟的mRNA。 选择性剪接：同一基因的转录产物由于不同的剪接方式形成不同mRNA。,组成型剪接和可变剪接,顺式和反式剪接,内含子剪接一般都是发生在同一基因内，切除内含子，相邻的外显子彼此连接，这种剪接称为顺式剪接（cis-splicing）。,反式剪接（trans-splicing）则是指发生在不同基因之间的外显子的剪接。,反式剪接发现于几种锥虫和线虫中。都是在mRNA 5端存在前导序列，称剪接前导R

26、NA（splicing leader RNA，sl RNA）。sl RNA的反式剪接表现了核内剪接系统的进化。,（五）RNA的编辑,概念：指转录产物RNA前体编码区发生碱基的突变、插入或丢失等现象。,近年发现某些mRNA前体的核苷酸序列需加 以改编，才能变成正确的有翻译活性的模板。 mRNA的这种编辑作用广泛存在于原生动物及 植物细胞的线粒体。,C变为U,非碱基的突变DNA水平 转换的频率远高于突变,6666位,mRNA编辑,尿苷酸的缺失和添加,1986.R.Benne在研究锥虫线粒体mRNA转录加工时发现mRNA的多个编码位置上加入或丢失尿苷酸，1990年在高等动物和病毒中也发现了编辑现象。

27、,锥虫coxII 基因的编辑,1986.R.Benne在研究锥虫线粒体mRNA转录加工时发现mRNA的多个编码位置上加入或丢失尿苷酸，,RNA编辑是基因转录后在mRNA中插入、缺失或核苷酸的替换而改变DNA模板来源的遗传信息，翻译出多种氨基酸序列不同的蛋白质。RNA编辑的结果不仅扩大了遗传信息，而且使生物更好地适应生存环境。有些基因的主要转录产物必须经过编辑才能有效地起始翻译，或产生正确的可读框(ORF)。,二、 rRNA前体的加工,原核细胞与真核细胞的rRNA前体都需加工：,1、原核细胞 rRNA 基因与某些 tRNA 基因构成混合操纵子。大肠杆菌共有7个转录单位，每个转录单位由16S rR

28、NA、 23S rRNA、 5S rRNA及一个或几个tRNA基因组成。,rRNA前体被大肠杆菌RNase,RNaseE等剪切成一定链长的rRNA分子； rRNA在修饰酶催化下进行碱基修饰； rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基,2、原核生物rRNA转录后加工，包括以下几方面：,大肠杆菌rRNA前体的加工,2、真核细胞 rRNA 基因为串联重复序列：由18S rRNA、 28S rRNA、5.8S rRNA基因 组成一个转录单位，彼此被间隔区分开。,每个重复单位之间的间隔DNA序列不转录，称为非转录间隔序列。,真核生物 5S rRNA基因也是成簇排列的，中间隔以不被转录的区域，它由RNA

29、pol 转录，加工成熟后构成核糖体大亚基。,不同生物的 rRNA 前体大小不同： 哺乳动物为45S；果蝇38S；酵母37S；四膜虫35S,18S,5.8S,28S,18S-rRNA,5.8S和28S-rRNA,内含子,45S转录产物,剪 接,终产物,rDNA,基因间隔,哺乳动物细胞 rRNA 前体加工过程,tRNA前体,三、tRNA前体的加工,原核与真核tRNA基因大多成簇存在。,tRNA前体的加工包括： 剪切内含子 核酸外切酶修剪3末端，逐个切去附加序列； 加上CCA-OH的3末端，完成柄部结构。 碱基修饰,RNaseP：5端修剪RNaseD：3端修剪RNase连接酶,1、剪切内含子：属于酶促反应，需要酶及ATP。,tRNA核苷酸转移酶,2、加上CCA-OH的3末端， 完成柄部结构。,3、碱基修饰,转录物前体形成茎环结构 RNase E、F切割3端 RNase D对3端修剪 RNaseP 对5端切除 RNase D再除去3端的两个核苷酸 tRNA进行碱基修饰,