DB11 T 376-2006 养殖鱼类病害防疫检疫技术规范.pdf
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1、 ICS 65.150 B 50 备案号: 19167-2006 北 京 市 地 方 标 准 DB DB11/T 376 2006 养殖鱼类病害防疫检疫技术规范 Rules of epidemic quarantining and prevention for familiar disease of cultured fish 2006-07-25发布 2006-10-01实施 北京市质量技术监督局 发布 DB11/T 3762006 I 前 言 本标准为常见鱼病防疫检疫技术操作规程。 本标准由北京市农业局提出并归口。 本标准起草单位:北京市农业局水产办公室。 本标准主要起草人:李继勋、杨华莲
2、。 DB11/T 3762006 1 养殖鱼类病害防疫检疫技术规范 1 范围 本标准规定了常见养殖鱼类的病害防疫检疫技术操作规范。 本标准适用于北京地区淡水养殖鱼类疾病的防疫检疫和管理。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的 修改单(不包 括勘误 的内容)或 修订版均不适用于本标准, 然而, 鼓励根据本标准 达成协议的各方研究 是否可使 用这些文件的 最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版 本适用于本标准。 GB ll607 渔 业水质标准 GB/T 15805.1-1995 淡水鱼类检疫 方法 第一部分 GB/T 18
3、407.4-2001 农产 品安全质量 无公害水产品 产地 环境 要 求 NY 5070-2002 无 公害 食品 水产 品中渔药残留限量 NY 5072-2002 无 公害 食品 渔 用配合饲料安全限量 NY 5171-2002 无 公害 食品 渔 用药物使用准 则 DB11/T 196-2003 常见鱼病防治技术操作规程 3 防疫调查 3.1 养殖的环境调查 3.1.1 周围环境 根据 GB/T 18407.4要求 的 各项指 标 进行调查。 3.1.2 养殖水源 调查养殖用水 来源和进排 水。 根据 GB 11607各项水 质指 标 调查 水 质的情况。 3.1.3 养殖水体 调查养殖水
4、体形状 、面积 、水 深 、底质及水 化因子情况。 3.2 养鱼史调查 调查养殖鱼类 发生鱼病的病 原 类 型、 发生频率、 药物的使用 情况 (包括药物种类、成 分 、用 量 和施 用次数) 。 调查放 养鱼 苗 、鱼种产地病 史 、检疫和 药物使 用 情况。 3.3 水质监测 3.3.1 气温和水温 采用水 银温度计、酒精摄氏温度计、 电子仪器测量 , 测 量时要注明当天 的气象情况。 3.3.2 水色和透明度 透明度采 用 透明 度板进行 测量 ,通过 目测观察养殖水 体 的水色以判断浮游 生物的 种 类和 数量。 3.3.3 水体 pH值 采用PH 试纸 、 比色测定计 、电 子 酸度
5、计进行 测定。 3.3.4 溶氧 使用碘 量法测定养殖水体 的溶氧量 。 3.4 化学物质测定 根据GB 11607 要求 的水 质指 标和方法进行分 析 。 3.5 池塘清整方法 3.5.1 清塘方法 DB11/T 3762006 2 调查 清塘消毒 方法(是 干塘清塘消毒法或 带水 清塘消毒 法) 和清塘 程 度 ,包 括淤泥的清理程度、 排水、除杂以 及塘基修 复情况。 3.5.2 清塘消毒药物 根据 NY 5171提 供的 药物进行清塘。 调查内容 包 括 清塘消毒时间 、 各种药剂名称 、用 量、 效果 及消 毒时 的操作方法的 调查。 3.6 饲养管理情况调查 包括饵 料来源、种
6、类、 投喂 方法、水 质 管理和 平时疾病预防方法等内容。 4 病原体的检查 首先确 定检 测 的鱼品种名 ,检 测器官部位、病 变程度 ,所 取 标本的情况, 再通过目检、 显微镜检 查、 病毒学 检测、细菌学检 测检查发病原因和 初步确定病 原体 的 种类。 4.1 检测及分类 4.1.1 目检 根据症 状通过目检 法 初步判断病 因和原病种 类。主要有 寄生 虫病、水 霉 、 原生动物、 蠕虫等; 根据 病鱼的 外表反应初步判断 和辨别病毒 和 细菌性 病原体 。 4.1.2 镜检 采用放 大镜 、 解剖镜、光学显微镜等 检 查法 。 4.1.3 分离、培纯以及感染试验 采用镜 检方法对
7、微 生物 性 病原 、病 毒 、 细菌进行检测 , 如对微生物 性病原 、病 毒 、 细菌的 细胞 形 态、 培养 特征、生理生化反应等 进行观察 、 测 定, 需要进一步进行分离 、培纯以及 感染 试 验。 4.2 寄生虫类病原体检查 对比较 大的 寄 生虫性病原体 , 宜 用放大倍数 低的 显微镜 或双筒 解剖镜检查。 4.2.1 玻片下观察 把从器官 或 组织上 分离出的 较 大 的寄生虫直接 放 在小玻璃皿 或 玻片上观察, 对较小 的寄生虫 要 把寄 主的 器官组织或内 含 物 压成薄层后进行观察 。 4.2.2 镜检 4.2.2.1 检鳃 从每一 侧鳃 的 第一片鳃片接近两端 的位
8、置取 鳃组织 。 4.2.2.2 检口腔 先用目 检方法观察 鱼 体表 面确 定有 无吸虫的 大胞 囊、 锚头藻 等, 再用镊子 刮 取上 下颌少许粘液进行 镜检。 4.2.2.3 检体 腔 将鱼腹 剖开 , 将 器官 暴露 , 观察脂肪组织、 肝、 胆囊、 脾等有 无肉眼可见的病原体。 如发 现有 白点 , 可能 是粘孢子虫或 微 孢 子虫。 还可发 现线虫、 绦 虫 、 棘头 虫等 成 虫和 囊蚴 。 目 检完毕后, 把腹腔液用吸 管吸 出,置于培养 皿里进行检查 。 4.2.2.4 检脂肪组织 通过目 检胃肠外壁的脂肪组织, 如果 发 现白点, 肉眼无法 判断时,可 用镊子取出,压片 进
9、行镜检。 4.2.2.5 检胃肠 先把肠 外壁 的 脂肪组织剔净 , 然后在前肠 (胃 )、中 肠 和后 肠三段上各 取少许, 滴上 生 理 盐水 进行 镜 检。 对寄生部位比 较固定的寄生虫 , 如 通常 寄生在后 肠近肛门 的位置的六鞭毛 虫、 变 形虫、肠袋 虫等, 通常 寄生在前肠( 胃) 或 中肠的复殖吸 虫 、 绦虫、 线虫和棘头 虫等。 4.2.2.6 检肝 和脾 先目检 肝 、 脾外表颜色和病灶 ,有 无溃烂、病 变 、 白点 和 肿瘤等。 如 有 白点 , 可 能是 粘 袍子 虫或 者 微袍 子虫 、球虫 。 然 后用 镊子从肝、脾上 取少许组织压片镜 检。 DB11/T 3
10、762006 3 4.2.2.7 检胆囊 把胆囊完 整 取 出后, 放 入培养皿中, 先通过目 检 观察外表 颜色和可疑的疾病 症状, 然后 剪开 , 放 出 胆汁 ,取一部分胆囊壁 放在载玻片上压片 进行镜检。 4.2.2.8 检心脏 用小剪刀剪开 胸腔, 取下 心脏 ,并 将心脏剪开, 取一滴内 含物 , 进行 镜 检,检 查 是否有锥体 虫 、 隐 鞭虫等 。同时取心脏组织少许 用玻片压展 法进行镜检。 4.2.2.9 检鳔 取鱼鳔 时保持鳔的完整, 观察其外表 , 然 后剪开 ,检 查有 无复殖吸虫、 线虫。 同 时取鳔组织少许用 玻片压 展法进行镜 检。 4.2.2.10 检肾脏 把
11、整个肾脏 完 整 地取 出。检查方法 同4.2.2.6 。检查 有 无粘孢 子虫 、 球虫 、 锥 体 虫、 隐鞭虫,复 殖 吸虫 、线虫等幼虫 。 4.2.2.11 检性腺 和膀胱 将左右 两个 性 腺完整取出, 进行目检。没有 膀胱 的鱼, 则检查 输尿 管。 4.2.2.12 检眼 把完整 的鱼 眼 睛放 在玻皿或玻片上, 剖 开 巩膜, 放出玻璃 体和水晶体 , 进行镜检,检 查 寄生在眼睛 的吸 虫幼虫。严重 感染吸虫时,水晶 体 变 白色, 混浊不透明 ,致 使 鱼眼失明。 4.2.2.13 检脑 按水平 方向, 从后向前 , 在后脑 和眼 睛之 间剪开头 盖骨 上壁 , 即见 到
12、充满着淡 灰 色泡沫状的 油脂 物 质,用 吸 管 把它 吸 出, 放 在玻皿里 , 以备检查。 吸净油 脂物质 后, 灰白 色 的脑即显露 出来 ,用 剪刀把它 完整 地取出来检查 。 4.2.2.14 检脊髓 从头部 与躯 干 交接处把脊柱骨剪 断 , 再把身体 的 尾部与躯 干交接处的脊柱骨也剪 断,用 镊子从前端 的断 口插入脊髓腔 , 把 脊髓夹住,慢慢地 把脊髓整条 拉 出来,然 后检 查。 4.2.2.15 检肌肉 从身体 的一 侧 面剖开一部分 皮肤 ,用 镊 子把 皮肤剥去 , 或用小 棍棒 (玻棒 或 竹棒 ), 象卷 纸筒一样, 慢慢 地把皮肤卷剥 。 剥去皮肤 后,肌
13、肉 即 露出来,经 目 检后, 再 进行 镜检。 4.3 原生 动物病原体的 计数 原生动 物不 同 种类个体大 小差异大, 除纤 毛 虫、 毛 管 虫以显微镜 低倍 视野 为单位 之外 ,其 他 种类如 鞭毛 虫、变形虫、 孢 子 虫均以显微镜 的 高 倍视野为单位。寄 生虫 或 病原体数量 用“十”号表示, “十” 表示 有 ;“ +”表 示多;“+ ” 表示很多。 必 要时可用文 字描述 。 具体表 示法: 在一 个视野里,有( 1-20) 个虫体记 “十 ” ,( 21-50) 个虫 体 记 “ +” , 51个 虫体 以 上记 “+ ” 。 关于胞囊的 计数则用文字说明 。 4.4
14、单 殖吸虫、线 虫、绦虫、棘头虫、甲壳动物和 软 体 动 物幼 虫的计数 在50个 以下 均 以数 字说 明, 50个 以上则说明 估计数字 或 者部分 器官 里 的虫体数 。 4.5 检查 时所 用的显微镜的倍数 显微镜 倍数 都 应注明, 低倍显微镜为 10倍 ; 高 倍 显微镜为 10倍 40倍。 微 型 病原体数量 的计 算 ,是 以同 一玻片中观察 的 平 均数为准。 5 病原体的 收集操作 对需要通过详 细观察其形 态结构才能鉴定和 需要 进一步 研究的病原体 , 应做好其标本的收集 、 固定 和保 存 。 5.1 病毒 DB11/T 3762006 4 收集病 毒性 病 原体标本
15、, 应 在无 菌 操作下收集 发 病早期的病鱼 带毒最多 的 组织 器官 , 保证病毒不致 灭活 。 5.1.1 病毒材料 的收集 取出病 变的器官组织置 于 无 菌器 皿中,然后 置于50% 的 磷酸 缓冲甘 油 中。注 明 收集 地 点、日期和寄 主种 类。 实验 室 距现 场 较近 , 可以直接检测 , 若实验 室 距现场 较 远, 需把病鱼 或病鱼器官 组织 放 入有冰 块的 保温瓶中,快速运往实 验室。保 存 温度 在-2O 50 。 5.1.2 病毒的分离培养 由于病 毒只 能在 活的组织 细胞 中 繁殖,鱼类病毒 分 离 培 养应 通过组织 培养。 5.1.3 病原悬液 的制备
16、将保存 在50% 缓冲甘 油的标本 (样 品) ,用 无 菌 生理盐水 冲洗 3次, 如是新鲜收集的器官 组织材料 , 测 量重 量后,用 剪刀剪碎, 按样品重量加入适 当比例的 缓冲 生理 盐水 (比例 为1:10至1:20) ,用 匀浆 器或 乳钵 将样品研成乳 状 , 以3000 转/min速 度离 心 20min, 吸取 上清液, 按 体积 1ml加入 青霉 素 800国际 单位、 链霉 素800 g,在 30 左右处理2h, 然 后于 5保存备用。 将离心 后的 上 清液,经滤 器过 滤 除菌,滤液 保存 备 用。 5.1.4 鱼体造 病感染 采用注 射或 浸 泡两种方法 ,同 时
17、设对照组观察 。 5.1.4.1 注射 感染 将病原 悬液 配 成一定浓度 , 从 鱼体腹鳍基 部进行腹腔 注射,用 量 视鱼体的大 小 而定,通常 每 尾注射 0.2ml 0.4ml。注 射 后 放入水族箱中 饲 养, 维持发病水温, 观察 发 病情况。 5.1.4.2 浸泡 感染 将病原 悬液和 无 氯自 来水 稀释 成 一定浓度 , 将健康鱼放 入其中 浸泡30min 后,移至水 族箱中饲养, 维持 发病水温,连续观察 鱼的发病情况。 5.1.5 细胞培养 与感染 采取组织 培 养的 方法进行 病毒 的 分离、 培 养, 制备 纯净 的病 毒抗原,通过 血清学试验 (如 中和试验) 与感
18、染 细胞的特异 变 化来进行 病毒的 鉴 定和 抗血清效 价 的滴 定等 。 5.1.6 原代细胞 培养 选择健康 鱼, 在 无菌 操作下解剖,取 出 组织 ,置 于 盛 有 EarIe氏平 衡 盐溶 液的无菌培 养皿中,用镊 子小 心除去 附着 的 组织 和血块,然后移入瓶 中,用Earle 氏 液洗 涤2 次 ,将组织 剪碎 ,成为 约 lmm大小的 组织 块,再 用Earle 氏 液洗1 次 ,加入相当于 组织量10 倍 (约 1份 组织 加 入9 份胰酶 )的25% 的 胰酶 , 在 25 消化 20min 30min, 消 化完毕 , 弃去胰酶液,用 Earle氏液 清洗2 次, 然
19、 后加 入 Eagles生长液 (Eagles 液加 入10% 小 牛 血清、 青 霉 素100 单位 /ml、 链 霉素 100g /ml ,用 5%NaHCO3, 调 节 pH7.27.4) ,用 吸管 反复 吸吹 , 以 助细胞分散 , 静 置片 刻 , 让没有 分 散 的 大颗粒沉 下, 然后 吸 取上层的细胞 悬 液 , 稀释 成 100 万单位 /ml的 浓 度, 接 种 入培养瓶( 若采 用 青霉 素瓶 作培养瓶, 则每 瓶 分装 1毫升 即可) , 盖紧瓶塞, 置 温 箱内 (温水性鱼类 可 在 22 28 )培养。 每隔 3d4d更换 培养液 1次 , 逐日 在 显微镜下观察
20、细胞 生长情 况。 Earle氏溶液配方见附 录A 。 5.1.7 病毒接种 选取生 长均匀 的单 层 细胞培养物 ,在无菌操作下, 吸 出细胞 瓶 内旧的培养液 ,以Earle 氏液清洗细 胞 1次 , 然 后 接 种 入 上 述制 备 好 的病 原 悬 液 (青 霉素瓶 可 接 种 0.2ml 0.4ml), 在 28 吸 附 30min 60min, 然后弃去瓶内 的病原悬液 ,加 入与 原来培养液等体积 的 维持 液 (即 Eagle液含 2% 6%小牛 血清 、 青霉 素100 单位/ml 、 链 霉素100 g /ml,pH 7.2 7.4),置 于28的条件下培 养,在显微镜 下
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