GB T 27817-2011 化学品.免疫毒性试验方法.pdf

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1、ICS 13.300;1 1. 100 A 80 中华人民化学品GE 共和国国家标准GB/T 27817-2011 免疫毒性试验方法Chemicals-Test method of immunotoxicity 2011-12-30发布，饲:!/ji看/ 中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会2012-08-01实施发布中华人民共和国国家标准化学晶免疫毒性试验方法GB/T 27817-2011 峰中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)5178

2、0235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销晤开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数19千字2012年4月第一版2012年4月第一次印刷祷书号:155066. 1-44710定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 27817-2011 前言本标准按照GB/T1. 1一2009给出的规则起草。本标准与美国环境保护局(USEPA)预防、农药及有毒物质预防办公室发布的生物化学品试验指南OPPTS 880.3550(1996)免疫毒性(EPABiochemicals Tes

3、t Guidelines OPPTS 880.3550 :1 996 , Immu notoxicity) (英文版)技术性内容一致。本标准作了下列结构和编辑性修改:一一将原文中的下列内容作为本标准的引言内容前言气(a)标题下(1)适用性和(2)背景气(b)标题下的(1)产品登记对免疫毒性试验的要求、(2)目的和(5)受试物;(f)标题下的内容免疫毒性试验的阶段性;一一增加了范围一章(见第1章)和规范性引用文件一章(见第2章); 一一计量单位改成我国法定计量单位。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本标准起草单位z中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所

4、、中国化工经济技术发展中心、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人z侯粉霞、李朝林、林铮、王晓兵、陈会明。I GB/T 27817-2011 51 本标准参考了USEPAOPPTS 880. 3550: 1996免疫毒性试验(英文版)，技术内容与试验指南OPPTS 880.3550(1996)免疫毒性相一致。该试验指南是美国环境保护局(USEPA)预防、农药及有毒物质预防办公室(TheOffice of Preven tion, Pesticides and Toxic Substances, OPPTS)发布的系列试验指南之一，受检对象为农药和有毒物质;所获得的毒理学资料提交后供EPA根据

5、有关法规进行审查。OPPTS发布的该试验指南是通过合并和权衡多个试验指南(包括污染预防和有毒物质办公室(theOffice of Pollution Prevention and Toxics , OPPT)发布的指南、美国规范大全中标题40下的第I章第R亚章中所述指南(Title40 , Chapter 1, Subchapter R of the Code of Federal Regulations , CFR)、农药规划办公室(theOffice of Pesticide Programs , OPP)、经济合作与发展组织(theOrganization for Eco nomic C

6、ooperation and Development, OECD)后最终形成的一个协调一致的指南。融合多个试验指南来形成单一一套OPPTS试验指南的目的是为了达到美国环境保护局对试验数据的要求，使试验方法的差异减小到最小。适用性:为了满足美国联邦关于农药、杀真菌剂和杀鼠剂条例的要求。背景:起草参考的原始文件是OPP指南152-180产品登记对免疫毒性试验的要求:产品登记对免疫毒性资料的要求根据情况而定。当要求开展亚慢性(90d)经口毒性试验(OPPTS870.3100)、亚慢性(90d)经皮毒性试验(OPPTS870.3250)或亚慢性(90d)吸人的毒性试验(OPPTS870.3465)时，

7、则要求开展免疫毒性试验;免疫毒性试验中动物的染毒途径应与亚慢性毒性试验的染毒途径相一致。目的:通过免疫毒性试验可以了解亚慢性染毒受试物(一般是经口染毒)对机体产生的健康损害作用。这些免疫毒性试验可以定性或定量评价受试物对抗体介导的体液免疫以及特异性和非特异性细胞免疫的影响。受试物:应测定受试物中每一种有效成分的技术等级。免疫毒性试验的阶段性:如果第一阶段的任何一项免疫毒性试验证明受试物具有免疫毒性，则应开展第二阶段的免疫毒性试验(OPPTS880. 3800)。如果第一阶段免疫毒性试验的结果不能被明确解释或有资料证明受试物或其结构类似物具有免疫毒性时，也许也应进行第二阶段免疫毒性试验。如果第一

8、阶段试验明确证明受试物没有免疫毒性，或没有相关资料可以证明受试物或其结构类似物具有免疫毒性时，不需要进行第二阶段试验。E GB/T 27817-2011 化学品免疫毒性试验方法1 范围本标准规定了化学品免疫毒性试验方法的术语和定义、试验原则、试验方法和试验报告。本标准适用于检测化学品的免疫毒性。2 规范性引用文件下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。美国环境保护局(USEPA)生物化学品试验指南OPPTS880.3800(1996)免疫反应(EPABiochem icals T

9、est Guidelines OPPTS 880.3800: 1996 , Immune Response) 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1 免瘟毒性immunotoxicity 受试物诱导免疫系统发生功能紊乱或不合适的抑制性或剌激性反应的能力。4 试验原则本标准中的免疫毒性试验，可以评价受试物是否改变或损伤免疫系统的机能状态。评价指标包括:免疫组织、免疫器官的重量及细胞结构;临床血液生化分析;血液学检查;体液免疫功能;细胞免疫功能。不同组的动物染毒不同剂量的受试物至少30d，每天对动物进行观察，记录所出现的任何临床毒性表现。染毒结束后，处死动物，对上述的评价指标进行检测或

10、分析;其中有些试验中需要用抗原将动物致敏。5 试验方法5. 1 实验动物5. 1. 1 种属和品系首选小鼠或大鼠，并使用常用的动物品系。如果使用其他种属的动物则应说明理由。所有动物应元寄生虫和病原菌。雌性动物应未产、未孕。5. 1.2 年龄应使用健康的动物。在试验开始时，单只动物的体重不应超过平均体重的土20%。于6周龄8周龄时开始染毒。5. 1.3 性别使用单一性别的动物。如果已知受试物对其中一种性别的动物更敏感，则应使用这种性别的动物。GB/T 27817-2011 5.1.4 数量对照组及各剂量组的每个观察指标测定时至少应包含10只动物。5.2 对照组应设立溶剂对照组，而且溶剂对照组中还

11、应另外包含一些动物，用于评价免疫毒性的可恢复性、持续性以及迟发性时作为对照见OPPTS880. 3800(d) (1)。溶剂毒性未知时，应设立一个不作任何染毒的对照组。为了说明方法的敏感性，应使用己知的免疫抑制剂(如，环磷酷胶)设立阳性对照组，每个观察指标至少需要5只动物。5.3 附加组高剂量组应设立附加组，至少包含20只动物，以高剂量组的剂量染毒30d，染毒结束后继续观察一段时间。od)，以评价免疫毒性作用是否可以恢复、是否持续存在、是否具有迟发性等情况见OPPTS880. 3800(d)(1)。5.4 剂量水平对于亚慢性毒性试验，常常期望得到受试物剂量-反应关系和元免疫毒性作用的剂量水平，

12、因此，至少应设3个剂量组和1个阴性对照组。高剂量应不使动物产生明显的应激、营养不良或死亡;但最好可使动物产生一些可测量的一般中毒表现。低剂量最好不使动物产生任何免疫毒性作用。5.5 染毒受试物或溶剂经口和/或经皮和/或经吸入染毒至少30d(一般经口染毒)，具体的染毒途径应与90 d亚慢性毒性试验的染毒途径相一致。5.6 观察期限观察期限至少为30d。附加组动物在停止染毒受试物后至少再观察30d，以观察免疫毒性作用是否恢复、是否持续存在、是否具有迟发性5. 7 动物的观察每天对动物至少进行一次细致的临床观察，记录中毒症状的出现时间、严重程度及其持续时间。观察应包括如下方面但并不仅限于此:一一皮、

13、毛;一一眼、茹膜;一一呼吸系统;自主性和中枢神经系统;一一循环系统;一一肢体运动功能;-一一行为特征;一抗感染能力等。每周测量一次动物的摄食量和饮水量。动物染毒前称体重，之后每周1次，处死前再次称体重。任何频死动物一被发现就应与其他动物分开并被安乐死。对试验过程中的任何濒死的或死亡的动物都应进行大体解剖。5.8 临床检验试验结束后，各剂量组和对照组各取10只动物进行临床检验。动物处死前应隔夜禁食。2 5.8. 1 血液学检测可包括下列指标:红细胞压积;血红蛋白浓度;红细胞计数;白细胞总数及分类计数;血小板计数。5.8.2 血液生化分析可包括下列指标:血糖;谷丙转氨酶;二一尿素氮;一一白蛋白;一

14、一总蛋白;一需要时可进行其他的临床生化分析。5.9 大体解剖所有动物都应进行大体解剖，包括:测量体重;一一测量胸腺和脾脏的温重，取出后应尽快称量以免脏器干燥35. 10 组织制备GB/T 27817一-2011各剂量组和对照组各取10只动物，取F列组织器官以及病变器官，用适当的固定液进行固定保存，用于组织病理学检查。这些组织器官包括:胸腺;一脾脏;二一肝脏;-肺脏;一一-肾脏;一一骨髓(股骨、胸骨或肋软骨部位的骨髓); 一一有代表性的淋巴结(薪膜附近的淋巴结或周围淋巴结);-一一肾上腺;垂体;一一卵巢或辜丸;所有肉眼可见的损伤。5. 11 检测脾脏、胸腺和骨髓的细胞结构及细胞活力。5. 12

15、对任何肉眼可见的损伤进行传统的组织病理学检查。5. 13 如果特异性和非特异性细胞免疫反应受到了影响，则应对上述组织或器官进行组织病理学观察。5.14 免疫毒性试验5. 14. 1 体液免疫试验首先用抗原免疫动物，然后采用抗体形成细胞检测CAntibodyPlaque Forming CeU，简称PFC试验，也称溶血空斑试验)方法或酶联免疫吸附(EnzymeLinked Immunosorbent Assay, ELISA)检测抗体滴度的方法评价受试物对体液免疫的影响。5. 14. 1. 1 PFC试验杰尼(Jerne)和诺尔丁CNordin)的PFC方法经卡尼海姆CCunningham)和森

16、博格CSzenberg)修改GB/T 27817-20门后叫，被用于检测亚慢性染毒受试物(30d)对脾脏内产生抗体的细胞的毒性作用。试验时，应对如下因素进行考虑:一一于染毒的第26天经静脉注射T细胞依赖性抗原绵羊红细胞(sheepred blood cells , SRBCs) ; 应对各种种属和品系的动物在注射抗原后测定PFC的最佳时间作出评价。一一测定每批补体的活性。一一对上述所引用的PFC方法存在一些修改(如参考文献22J中特目普(Temple)的方法)C22，这些修改可能是有用的。但是，引用某种方法时应对方法进行整体引用，对方法所做的任何修改都应予以说明并能证明其合法性和合理性;应说明

17、主要试剂的来源，最好也能说明这些试剂的活性或纯度。一一为了验证试验方法的敏感性，应设立经免疫抑制剂(如，环磷眈胶)染毒的阳性对照组。一一使用双盲法进行PFC计数。一一测定脾细胞的活性。5. 14. 1.2 定量测定免疫球蛋白通过该试验评价受试物是否影响抗体对抗原的反应性。在染毒结束前4d5 d，用适当的胸腺依赖性抗原免疫动物后，经过适当的时间再次用抗原免疫动物，然后测定每只动物血清中IgG和IgM的滴度。测定抗体滴度的时间点应足够多，以便对染毒组和对照组动物的初级抗体反应和次级抗体反应进行比较。测定抗体时受试物的染毒时间至少为30d。试验时，应对如下因素进行考虑:测定血清中IgG和IgM滴度的

18、方法应足够敏感以便测得每只动物的IgG和IgM滴度。ELISA方被认为是一种灵敏、可靠、重复性好的方法。5.14.2 特异性细胞免疫反应为了评价亚慢性染毒受试物(30d)对特异性细胞免疫反应的影响，应采用下列三种方法中的一种进行试验。5.14.2.1 单向混合淋巴细胞培养法(One-wayMixed Lymphocyte Culture, MLC) 该方法可以证明亚慢性染毒受试物(30d)对同种异品系淋巴细胞剌激引起的淋巴细胞增值能力的影响。通过测量放射性标记物(一般为3H-胸腺喃院)掺入DNA的量来说明淋巴细胞的增殖。试验时，应对如下因素进行考虑:应答细胞来自对照组和染毒组动物的脾细胞，在元

19、菌条件下制备脾细胞。应答细胞的DNA合成没有采取阻断处理;剌激细胞来自未经染毒的同种异品系动物的脾细胞，在元菌条件下制备脾细胞。剌激细胞的DNA合成用丝裂霉素或X线处理进行阻断E一一测定应答细胞和剌激细胞的活力;应设3份或4份对照，用于证明收获细胞的效益、保证剌激细胞的非反应性、测定DNA合成的基础水平;一一一对空白对照和溶剂对照同时进行测定;一一用每个培养皿中掺入应答细胞的放射性标记物的量来表示脾细胞的增殖程度，表示为每分钟居里数(curieper minute, CPM)。要计算净CPM(nCPM) ，即，应答细胞被剌激细胞剌激后参人的CPM均值减去未经剌激的脾细胞参入CPM的均值。染毒组

20、与对照组差异的百分比表示为:1-(染毒组nCPM/对照组nCPMJ;一-不同的单向?昆合淋巴细胞培养法中存在许多不同，应说明所引用的试验方法及详细的试验步骤，说明主要试剂的来源，最好也说明这些试剂的纯度;一一为了证明方法的灵敏性，应设立阳性对照组，用己知的免疫抑制剂进行染毒。5.14.2.2 迟发型过敏(Delayed-typeHypersensitivity, DTH)反应该方法是一种检测受试物对实验动物诱导性DTH影响的体内方法。一般来说，动物被胸腺依赖4 GB/T 27817-2011 性抗原致敏，之后用相同的抗原进行激发，激发后24h48 h，比较染毒组和对照组DTH反应的差异。开展该

21、试验时，应对如下因素进行考虑:一一DTH检测方法有数种，应选用灵敏度高、可重复性好、并适用于所选用实验动物品系的方法;一一不同的方法中下列参数也可能不同，如，致敏及激发动物所用抗原的性质，免疫性注射的次数及途径，免疫激发的时间，同位素的使用等。试验时选用的这些参数及其他相关的参数应可以使所选用的实验动物产生足够的DTH反应;-一一测定DTH反应前，应对动物染毒至少30do 5.14.2.3 细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicT -lymphocyte, CTL)检测该方法用于证明亚慢性染毒受试物(30d)对CTL生成的影响。该试验中使用同种异品系肿瘤抗原对CTL进行诱导(体内或体外诱导)，

22、然后，来自染毒组和对照组动物的脾细胞与51Cr标记的同种异品系肿瘤细胞共孵育，4h后，肿瘤细胞所释放的放射性标记物的量可以说明T淋巴细胞溶解肿瘤细胞的能力。试验时，应对如下因素进行考虑:一一应设立对照组来测定效应细胞不存在时靶细胞释放的放射性标记物的本底量和放射性标记物的总的释放量;一一应可以证明试验中所选用的动物可产生CTLs，所选用的试验方法应适合于诱导动物CTL的生成;一CTL检测有数种不同的方法，引用某一种方法时应做到完全引用，对方法进行修改时应予以说明，合适的情况下应说明主要试剂的来源、活性和/或纯度。5. 14.3 非特异性细胞免疫反应通过测定NK细胞的功能、巨噬细胞数及其吞噬作用

23、可以评价亚慢性染毒(30d)受试物对非特异性细胞免疫的影响。5.14.3.1 NK细胞的活性(naturalkiller cell activity) 建议采用瑞纳尔兹(R巳ynolds)和贺伯门(Herberman)的微量培养法:17J来检测亚慢性染毒(30d)受试物对NK细胞活性的影响。染毒组和未染毒组动物的脾细胞与51Cr标记的YAC-l淋巴瘤细胞共培养。靶细胞与效应细胞共培养4h后，靶细胞中释放的放射性标记物的量可用于表示NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力。开展该试验时，应对如下因京进行考虑:一二应设立几个对照以说明在没有效应细胞存在时，靶细胞释放放射性标记物的本底量以及放射性标记物总的释放量

24、;试验使用除YAC-l淋巴瘤细胞之外的靶细胞也许是合适的。任何情况下都应测定靶细胞的存活力;也许需要对方法的某些步骤进行修改，但是，引用某种方法时应对方法进行整体引用，对方法所做的任何修改都应予以说明并能证明其合法性和合理性;应说明主要试剂的来源，最好也能说明这些试剂的活性或纯度。5. 14.3.2 巨噬细胞检测该试验可以评价亚慢性染毒(30d)受试物对巨噬细胞数及其吞噬功能的影响。应对如下方面进行检测:一一试验中应计数腹腔细胞的总数及分类计数;一一评价在有或没有促进因子(如，干扰素或细菌脂多糖)存在的情况下腹腔细胞对颗粒(如，荧光乳液珠的吞噬作用。一-一有数种不同的巨噬细胞检测方法，因此，应

25、对所选用的方法进行描述并说明方法引证的来源;如果对所选用的方法作了一些修改，则应说明修改的合理和合法性。5 GB/T 27817-2011 6 试验报告6 除总则规定的一般项目外，鉴定报告还应包括以下内容:一一统计方法;一动物级别及饲养条件的详细信息;一一实验室免疫毒性试验历史资料的测定值;减少免疫毒性测定值波动的方法。GB/T 27817-20门参考文献lJ Cunningham, A. J. A method of increased sensitivity for detecting single antibody-forming cells. Nature, 1965 ,207: 11

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