WS T 358-2011 血清(浆)脂蛋白(a)的免疫测定.pdf

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1、lCS 11 . 020 c 50 ws 中华人民共和国卫生行业标准WS/T 358-2011 血清（浆）脂蛋白（a）的免疫测定Immunoassay of serum or plasma lipoprotein(a) 2011-12-14发布2012-06-01实施中华人民共和国卫生部发布WS/ T 358-2011 日IJ吕才、非tif刊主llf!Cl- ” J 1. l-200lJ约Ii，的规则赵布：水际汗I兰主碍。:RI可到家，白床实验伞标准化委员会（川1onWS/T 358-2011 5. 2 采血方法取前臂静脉血。止血带的使用不超过lmin.避免洛血。5. 3 重复采血因分析和生理

2、因素影响结果可重复测定a应在1周8周内对同一受试者采血测试2次以上，取均值。5. 4 样本的处理和贮存一般采用血清或血浆测定3血清样品采取后在室温静置30min 45 min令其自行凝固，3h内离心分离血清。血浆测定结果高于血清3样品宜尽快检测，如当日不能完成，在4保存不超过4d . 20下可保存6个月，70保存时间更久。避免反复冻、融。长期冰冻可引起Lp(a）测定结果升高。6 测定方法Lp( a）的免疫化学定量方法包括：a) 凝胶分析：单向免疫扩散（RadialImmunodiffusion . RID）、电泳免疫测定（Electro1mmunoassay, EIA); b) 液相分析：免疫

3、透射比1虫测定ClmmunoturbidimetricAssay, IT A）、免疫散射比浊测定Clmmunonephelometry Assay, IN A）、乳胶凝集免疫透射比浊法（LatexAgglutinative Immunoturbi di metric Assay, LAIT A) ; c) 固相分析：酶联免疫吸附测定（Enzymelinked immunosorbent assay, ELISA）、放射免疫视定( radioimm unoassay, RIA）、荧光免疫测定（Fluoreacenceimmunoassay,FlA) o 目前国内临床实验室常用的方法主要为免疫透射

4、比浊法，IFCCLp(a）测定标准化计划采用ELISA为参考方法。6. 1 免瘟透射比浊测定6. 1. 1 原理待测标本中Lp(a）与试剂中特异性抗体相结合，形成抗原抗体复合物，使反应液中浊度增加，透射光被吸收的量与免疫复合物量呈正相关，而复合物量与抗原和抗体的量亦呈函数关系。通过Lp(a）校准血清所作的剂量效应曲线计算待测标本中Lp(a）含量36. 1. 2 仪器免疫透射比浊法须用班长340nm i虑光片分光光度计。检测大批样品宜用全自动或半自动生化分析仪。使用手工操作的光度计或半自动分析仪，还应配备高精密度的稀释器及加样器。光度计吸光值读数在1.0时，不精密度CCV)小于1%。6. 1.

5、3 试剂的配制6. 1. 3. 1 样品稀释液CR1) 一般为pH7.4 8. 0的磷酸盐或TrisHCl缓冲液，含聚乙二薛6000、表面活性剂和Na风，340 nm处吸光度应O.03 ,4可存放1年3WS/ T 358- 20 11 6.1.3.2 抗血清应用液CR2)apo(a）抗血清，部分或全部Rl成分可添加蛋白质或氨基酸作为稳定剂，试剂应无色透明，340nm 处吸光度应0.03.4可存放1年36. 1. 4 参考物质包括校准物和质控物。按IFCCLp(a）测定标准化的量值传递方案对校准物和质控物进行赋值，使其准确性可溯源至国际参考物质。6. 1. 5 操作步骤6. 1. 5. 1 手工

6、操作免疫比1虫手工测定LpCa）必须采用双试剂法，除去血清（浆）样品及试押lRl、RZ空白读数。不同批号试剂测定必须做校准曲线，以50mg/ L 800 mg/L浓度范围内4点6点为宜。样品用量根据不同的抗体和测定条件，样品与反应总体积比为1: 30 1 : 50，放长340nm,20以上反应20min, 6. 1. 5. 2 自动化分析采用双试剂、双波长（如340nm/600 nm），二点法进行自动化分析，根据反应进程确定读点时间，一般为Bmin 10 min。样品与反应准总体积比为1: 20 1 : 40.剂量效应曲线同手工法，用非线性Logit-log4P C 5P）或样条函数拟合曲线计

7、算结果。6. 1. 6 技术指标6. 1. 6. 1 精密度批内CV：自动化分析仪4%，手工法8%，试剂空白吸光度O.05, 6. 1. 6. 2 灵敏度LpCa）浓度在200mg/L时吸光度值读数位于0.040.07。6. 1. 6. 3 特异性抗体应仅与待测样本中Lp(a）和游离apo(a）发生特异性反应，而与待测样本中其他血浆蛋白无非特异性反应。6. 1. 6. 4 检测范围检测范围：Lp(a）下限20mg/L、上限二三800mg/ L, Lp(a）浓度为1200 mg/L时不发生抗原过剩现象。6. 1. 6. 5 抗干扰能力胆红素水平200mg/L、血红蛋白5000 mg/L和甘油三醋

8、6mmol/L的样本对测定结果无影响。严重脂浊标本对测定有干扰。乳廉血症的样本可将血清放置冰箱过夜或高速离心吸出液面奶油样层后再行测定36.2 酶联免症吸附测定大多采用单克隆或多克隆抗apo(a）建立的双抗体夹心法；亦可采用抗apo(a）和抗apoB为捕获和J WS/ T 358-2011 检测抗体建立的ELISA法，抗apoB抗体与纤榕酶原无交义反应可有效地排除纤维蛋白搭醋原干扰。本法的关键技术是保证酶标记抗体稳定；分析变异主要由高倍稀释样本引起。本法灵敏度高、恃异性好高血脂、阻红素等无干扰，可孚工操作或自动化分析37 参考方法采用IFCCLpCal泪lj定标准化计划所确定的参考方法。分另l

9、j采用单克隆抗体a-6（识别KringleIV -2) 和a-40（识另IKringle凹9）为包被、检测抗体建立的ELISA法。由于得一个Lp(a）分子仅含一个Kringle IV -9拷贝，本法不受apo(a）多态性的影响。8 参考物质8. 1 一级校准物的制备由两个强立的国际参考实验室分别从同一份新鲜血清中提取Lp(a）纯品，该血清中apo(a）表型为单一区带，KringleIV斗的拷贝数为19；分别采用超速离心和各自的层析技术（赖氨酸琼脂糖或S ephacryl S 400）分离、纯化Lp(a）。提纯的Lp(a）经氨基酸分析进行定量，LpCa）绝对质m:用摩尔单位表示；该参考物质的反应

10、性与新鲜血清或血浆中Lp(a）具平行性。8.2 二级技准物的制备用Lp(a）一级校准物作标准，经参考方法对二级校准物SRM2BC冻干人血清，含蔚糖、赖氨酸和NaN3等，KringleN-2拷贝数以16、17和18为主）进行赋值，为107nmol/L。2004年SRM28被IFCC正式接受为Lp(a）的国际参考物质，即二级校准物。8. 3 制造商工作校准物和产品校准物的制备按与WHO/IFCCapoAl ,B测定标准化相同的量值传递方案对制造商工作校准物、产品校准物进行赋值，使其准确性可溯源至国际参考物质。9 参考范围人群中血清（浆）Lp(a）水平呈偏态分布，个体差异极大，健康人群含量范围为：O

11、mg/ L 1 000 mg/L。高Lp(a）已确认为动脉粥样硬化性心血管疾病的独立危险因素。一般将Lp(a）参考值定为300mg/ L 以下。基于标准化的Lp(a）参考值有待确定。10 建议Apo(a）有多种多态性其分子大小的不均一性对免疫化学测定Lp(a）的结果有着不同程度的影响。由于参考物质与待测样本中apo(a）的大小、分布不可能完全一致，即使采用国际参考物质亦不能避免测定结果的不准确性，从而高估或低估Lp(a）值。另外，apo(a）分子大小的不均一性对不同测量程序的测定结果影响程度不同，即抗体对不同分子大小的apo(a）反应性和亲和性间的差别，导致不同测量程序间结果的可比性出现差异。

12、因此，不同测量程序、商品试剂盒间的测定结果存在着差异3保持具不同Lp(a）水平的待测样本中apo(a）大小尽可能与校准品一致，可有效减少apo（川的颗粒大小不同造成的测定差异，即不采用同一校准品的系列稀释物，而选用5份apo(a）分子大小不同的校准品（从小到大对应于相应的Lp(a）水平）替代以前来源于单一标准品的系列稀释物作为测定用系列参考物质。WS/ T 358- 201 1 LpC a）国际参考物质中Lp(a）值采用nmol/L表示吨基于标准化的Lp(a）参考（直尚有待确定2现阶段建议如下：a) 临床和流行病学研究中要尽量减少或排除apo（川大小引起的偏差以准确测定LpCa）水平：b )

13、要求Lp(a！生产厂家力争将apo(a）大小引起的测定偏差、不精确等影响降到最低；c) 协调、统一样本的收集、储存方法；d ) 校准物11.溯源于WHO认可的IFCC二级参考物质；巳）现阶段不建议对普通人群进行高LpCa）筛查。建议对心血管疾病高危人群LpCa）水平进行溃。定，特别是LDL-C处于临界水平或高apoB水平的人群3对高Lp(a）人群宜进行干预，针对性地改善危险因素；) 如果测定方法受apo(a）大小的影响，大于50nmol/L的LpCa）样本宜重测，由建立有效方法的参考实验室承担37 WS/ T 358-20门参考文献=l JC、L只指而.: l / L1 i八ISB卡1S6?.

14、38 33 1-0 ) : 19 97 Apoiporte111 1mm111 川忖扒IY叭d山V巳l- （lm巳ntl nd re Om口1巳nd已dl巳rform1incechm川terr义ll刊，aprov叭lguiJvlinc 汀lineJR. Rifai N . J:lerg K. et ii. Int巳rnation11lfed巳rationof JiniCil chemistry st11mlHd1z11rion抖。eel for heme川lrem巳noflioprotein（日）. Ph飞巳1. E valuation of th巳11n1tlytic1tlp巳Iiorm1

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