NY T 912-2004 饲料添加剂 纤维素酶活力的测定 分光光度法.pdf

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1、ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 912-2004 饲料添加剂纤维素酶活力的测定分光光度法Determination of cellulase activity in feed additives -Spetrothoetric method 2005-01-04发布2005-02-01实施中华人民共和国农业部发布NY /T 912-2004 目U1=1 本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国农业大学农业部饲料工业中心、芬兰饲料国际有限公司、广东溢多利生物技术股份有限公

2、司、辽宁众博饲料科技有限公司、北京中农博特生物工程技术有限公司、武汉新华扬生物有限公司。本标准主要起草人:谁仕彦、陆文清、刘兴海、李德发、邢建军。I 1 范围饲料添加剂纤维素酶活力的测定分光光度法本标准规定了用还原糖比色法测定饲料添加剂中纤维素酶的活力。NY/T 912-2004 本标准适用于饲料添加剂用的饲料酶产品，也适用于含有纤维素酶的添加剂预混合饲料。样品的最低检出量为1.0u/go 2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后的所有修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这

3、些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBf 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。纤维素酶活力单位在37C、pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为4mg/mL的竣甲基纤维素铀溶液中降解释放1mol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。4 原理纤维素酶能将竣甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的

4、活力。菁告:在处理酸、碱和配制DNS试剂时，请戴上保护眼镜和乳胶手套，实验应在通凤橱或通凤良好的房间进行。一旦皮肤或眼睛接触7上述物质，应及时用大量的水冲洗。5 试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GBf6682中规定的二级水。5.1 氢氧化铀溶液，浓度c(Na。因为200glL 称取氢氧化纳20.0g，加水溶解，定容至100mL。5.2 乙酸溶液，浓度c(CH30)H)为0.1mollL 吸取冰乙酸0.60mL，加水溶解，定容至100mL。5.3 乙酸铀溶液，浓度c(CH3C)Na)为0.1mollL 称取三水乙酸铀1.36g，加水溶解，定容至100mLo 5.4 乙酸一

5、乙酸铀缓冲溶液，浓度c(CH30)H-CH3C)Na)为0.1mollL, pH为5.5NY/T 912-2004 称取三水乙酸铀23.14g，加入冰乙酸1.70mL。再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH。如果pH偏离5.5，再用乙酸溶液(5.2)或乙酸纳溶液(5.3)调节至5.505.5 葡萄糖溶液，浓度c(;H12!5 )为10.0mg/mL 称取无水葡萄糖1.000g，加乙酸一乙酸铀缓冲液(5.4)溶解，定容至100mLo 5.6 楼甲基纤维素铀溶液，浓度为8.0glL 称取竣甲基纤维素铀(SigmaC5678)0. 80 g，加入80mL乙酸一乙酸铀缓冲溶液(5.4)。磁力搅

6、拌，同时缓慢加热，直至竣甲基纤维素纳完全溶解(注:在搅拌加热的过程中，可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100mLo)。然后，停止加热，继续搅拌30min，用乙酸一乙酸铀缓冲溶液(5.4)定容至100mLo接甲基纤维素铀溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4C避光保存，有效期为3do 5.7 DNS试剂称取3，5-二硝基水杨酸3.15g (化学纯)，加水500mL，搅拌5s，水浴至45C。然后逐步加入100mL氢氧化铀榕液(5.1)，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明(注意:在加人氢氧化铀过程中，榕液温度不要超过48C0)。再逐步加人四水酒石酸伺纳91.0g、苯酣2.50g和无水亚硫酸铀2

7、.50g。继续45C水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加人的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用，有效期为6个月6 仪器与设备6. 1 实验室用样品粉碎机或碾钵。6.2 分样筛孔径为0.25mm(60目)0 6.3 分析天平感量0.001g。6.4 pH 计精确至0.0106 5 磁力搅拌器附加热功能。6.6 电磁振荡器6.7 烧结玻璃过滤器孔径为0.45m。6.8 离心机3000 r/mino 6.9 恒温水浴锅温度控制范围在30C60C之间，精度为0.1Co6.10 秒表每

8、小时误差不超过5s。6.11 分光光度计能检测350nm 800 nm的吸光度范围。6.12 移液器精度为1L。6.13 冰箱2 NY IT 912-2004 7 标准曲线的绘制吸取缓冲液(5.4)4.0mL，加人DNS试剂(5.7)5.0mL，沸水浴加热5mino用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样O分别吸取葡萄糖溶液(5.5)1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL, 分别用缓冲液(5.4)定容至100mL，配制成浓度为0.10mg/mL - 0 . 70 mg/mL葡萄糖标准溶液。分别吸取上述放度系列的葡萄糖标

9、准搭液各2.00mL(做2个平行)，分别加入到刻度试管中，再分别加入2mL水和5mLDNS试剂(5.7)。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后，用自来水冷却到室温，再用水定容至25mLo以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。8 试样溶液的制备固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛(孔径为0.25mm)，按照附录A中建议的称样量称取试样2份，精确至0.001g。加人40mL乙酸一乙酸铀缓冲溶液(5.4)。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液(5.4)定容至100mL，在4C条件下避

10、光保存24h。摇匀，取出30mL-50mL，上离心机离心3mino吸取5.00mL上清液，再用缓冲溶液(5.4)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04 U/mL-0.08 U/mL之间)。液体样品可以直接用乙酸一乙酸铀缓冲溶液(5.4)进行稀释、定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04U/mL-0.08 U/mL之间)。如果稀释后酶液的pH偏离5.5，需要用乙酸溶液(5.2)或乙酸铀溶液(5.3)调节校正至5.5，然后再用缓冲溶液(5.4)做适当稀释定容。9 测定步骤吸取10.0mL竣甲基纤维素纳溶液(5.6)，37C平衡10mino 吸取1O.0mL经过适

11、当稀释的酶液，37C平衡10mino 吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过37C平衡)，加入到刻度试管中，再加入5mLDNS试剂(5.7)，电磁振蔼3s。然后加人2.0mL竣甲基纤维素铀溶液(5.6)，37C保温30min，沸水陆加热5mlno用自来水冷却至室温，加水定容歪25mL，电磁振荡3s。以标准空白样(参见7)为空白对照，在540 nm处测定吸光度ABo吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过37C平衡)，加人到刻度试管中，再加入2.0mL殷甲基纤维素铀(5.6)(已经过37C平衡)，电磁振荡3s，37C精确保温30mino加入5.0mLDNS试剂(5.7)，电磁振荡3s，以终

12、止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s。以标准空白样(参见7)为空白对照，在540nm处测定吸光度衔。10 试样酶活力的计算试样纤维素酶活力按式(1)、式(2)计算。(AE-AR)xK十。XD=l12tl000. (1) 式中:XD一一试样稀释液的纤维素酶活力，单位为酶活力单位每毫升(U/mL);AE一一一酶反应液的吸光度;AB一一酶空白样的吸光度;K一一标准曲线的斜率;3 NY /T 912-2004 G一一标准曲线的截距;M一一葡萄糖的摩尔质量M(C;H1206)= 180.2 g/mol; t一一酶解反应时间，单位为分钟(min); 1000

13、 转化因子，1mmol= 1000molo XD值应在0.04U/mL-0.08 U/mL之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。X=XDXDj . . . . (2) 式中:X一一试样纤维素酶的活力，单位为酶活力单位每克(U/g); Dj一一试样的总稀释倍数。酶活力的计算值保留3位有效数字。门重复性同一试样两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留3位有效数字)。4 纤维素酶活力，U/g2000 5002000 200-500 50200 10-50 11O 附录A(资料性附录)建议称样量称样最，g0.10.2 0.20.5 0.

14、51.0 1.02.0 2.05.0 5.0 10.0 NY /T 912-2004 5 寸CON-N5Hhz中华人民共和国农业行业标准饲料添加剂纤维素酶活力的测定分光光度法NY /T 912-2004 争非中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)争夺争夺(邮政编码:100026 网址:) 中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销* 争等争夺字数7千字向J长0.75开本880mmx1230mm 1/16 2005年4月北京第1次印刷定价:8.00元版权专有侵权必究举报电话:(010) 65005894 印数:1-2000册2005年4月第1版书号:16109 517 NY厅912-2004