SN T 1280-2014 国境口岸鼠疫检验规程.pdf
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1、人共和境检检疫行标;SN/1280-2014 代替SN/T1280-2003 境口岸蘸踵栓验规程Inspection codes for plague at frontier port 2014-04-09发布2014-11-01实施中华人民共和ME发布匪家股量监督检验检疫总局目自吕本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替SN/T12802003(国境口岸鼠疫检验规程。本标准与SN/T12802003相比,主要技术变化如下:一一一修改了规范性引用文件:GB 15991 1995修改为ws279; SN/T 1280-2014 一修改了要求专用实验室修改为卫生部人间传染的病原
2、微生物名录规定的相应等级的生物安全实验室,条件具备用聚合酶链式反应(PCR)修改为用鼠疫特异抗原和抗体检测及基因检测;修改了检验程序;一一修改了结果判定;一一修改了附录A、附录B、附录D,附录B修改为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局和中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人:王东胜、乔舜、魏怀波、囚丽、孟东平、孙利。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:SN/T 12802003。I SN/1280-2014 国境口岸摄疫检验规程1 范围本标准规定了国境口岸鼠疫检验的
3、实验室生物安全规范、材料的采集、保存和运输、检验程序、结果判定。本标准适用于国境口岸2 规范性引用文件WS 279 鼠疫诊断标准人间传染的病原微生物名录(卫可感染人类的高致病性病原微生3 要求3.1 3.2 3.3 应两人以上同时进入实验室工3.4 及时准确做好检验的各项实验3.5 用鼠疫特异抗原和抗体检测(4 准备4.1 设备和材料天平;离心机、离心管;震荡器;温箱;皿;灭菌小试管;1mL注射器;血凝微量板、稀释棒;定量滴头。4.2 培养基和试剂4.2.1 鼠疫菌检验1-,仅注目期的版本适用于本文生部)级的生物安全实验室内进行。等,见附录A。口岸鼠疫的快速初步检验。;带盖自瓷缸;接种棒、自金
4、耳;平95%乙醇;生理盐水;革兰氏、美兰染液;溶血(0.1%)赫氏琼脂平板培养基(培养基的制备见附录C); 龙胆紫(1: 10万)(l: 20万)J亚硫酸铀(0.025%)平板或龙胆紫溶血平板培养基;鼠疫噬菌体。4.2.2 闰接血凝试验(lHA)4.2.2.1 2.5% F1抗原致敏血球。用细菌凝集效价为1: 320以上的鼠疫全菌免疫血清滴定、血凝滴度应不低于1: 40 000;与假结核血清交叉滴定、滴度应不高于1: 5;符合上两项规定的致敏血球为合格诊断用血球,每一鼠疫季节开始前或更换致敏血球批号时应进行上述滴定。SN/T 1280-2014 4.2.2.2 1%正常兔血清盐水。4.2.2.
5、3 2.5 %单宁酸血球。4.2.2.4 F1抗原液(50g/mL100g/mL)。4.2.3 反向血凝试验(RIHA)2.5%鼠疫抗体致敏血球;1%正常兔血清盐水;鼠疫诊断血清。5 疑似鼠疫材料的采取、保存和运输按附录D的规定执行。6 检验程序6.1 鼠疫菌检验6. 1. 1 镜检6. 1.1. 1 涂片6. 1. 1. 1. 1 取材腺、肝、脾、肺、心,用切面在洁净玻片上压印或涂成薄片;或取骨髓、脑脊液及各种渗出液、痰,用接种环直接涂片。至少2张,室握下自然干燥,人体及自死动物材料至少涂4张片。6. 1. 1. 1. 2 用95%乙醇或乙醇、乙酷各半配制的固定液固定10min,取出自然干燥
6、。6. 1.1.2 染色涂片进行革兰氏染色和美兰染色。6.1. 1.3 镜检发现革兰氏阴性、两极浓染、两端钝圆的短小球杆菌,为符合鼠疫菌的特点。注意腐败材料或陈旧材料菌本身形态的变化。6. 1. 2 细菌培养按WS279的规定执行。6.1.3 鼠疫噬菌体裂解试验按WS279的规定执行。6. 1. 4 动物接种按WS279的规定执行。6.2 血清学检验6.2.1 间接血凝试验(lHA)按WS279的规定执行。6.2.2 反向血凝试验(RIHA)按WS279的规定执行。2 7 结果判定7.1 鼠疫菌判定依据按WS279的规定判定。7.2 间接血凝试验的结果判定按WS279的规定判定。7.3 反向血
7、凝试验的结果判定按WS279的规定判定。SN/T 1280-2014 3 SN/T 1280 2014 附录A(规范性附录)最疫实验室生物安全规范A.1 导吉由于鼠疫菌特别危险的性质,对鼠疫实验室有不同于一般细菌学实验室的特殊要求。鼠疫菌检验应在卫生部人间传染的病原A.2 鼠疫实验室结构A.2.1 普通鼠疫实验室实验室宜设立于独立的建筑物强毒操作区应安装带有除菌滤虫措施,防止陆齿类动物或昆实验室的强毒区域内,设材料接检室(接受材料、检蚤在强毒区域之外,宜根据需清学试验、高压、洗涤以及健A.2.2 生物安全E级实验在普通鼠疫实验室内装要求。A.2.3 生物安全E级实验在生物安全H级的基础全实验室
8、内进行。种及饲养室,如果有条件可增设疑似统。在实验室的强毒区和其他辅助E级实验室,可简化进入实验室的着出实验室时空气流向为由外向内,保证实验室内空气流向自上而下,无横二向过施细萦流,并维孽茹耍的洁净度,即达到生物安全皿级标准。适用于特别危险,容易产生气榕胶的实验操作,并具备较强的抗御事故能力。A.3 鼠疫实验室工作制度A.3.1 进行鼠疫实验室操作时,需有两名工作人员同时进入。A.3.2 非实验室工作人员一律禁止进入鼠疫强毒实验区。A.3.3 实验室内禁止吃东西、吸烟和喧哗。A.3.4 全体工作人员经鼠疫正规培训后方可进行强毒操作,并严格按照鼠疫菌强毒操作规程和其他国家标准进行各项实验,准确记
9、录实验结果。A.3.5 工作人员要熟知实验室常规感染途径和掌握个人防护措施。A.3.6 建立工作人员基础医学检测卡片。A.3.7 工作人员如有皮肤损伤、发热、感冒、抵抗力低下和娃撮者,不应进入强毒实验区。4 SN/1280-2014 A.3.8 工作完毕,检查实验室水、电、防火设备,打开防盗报警装置。A.4 鼠疫实验室着装要求A.4.1 普通鼠疫实验室按下列顺序穿着防护服装:穿内隔离衣裤;穿防蚤袜及长筒胶靴;戴白帽和小口罩(两鼻翼与小口罩间用适量脱脂棉填充):扎三角头巾及帽子;穿后开口的白大衣(偏衫);戴20层24层的纱布大口罩:戴医用手术手套,必要时外面套细线手套;进行已知毒菌动物接种、解剖
10、或菌种开封等工作应戴有机玻璃面罩或眼镜,以防操作时细菌溅入眼内或脸部裸露皮肤;或在无菌罩中进行。A.4.2 在配备生物安全柜的生物安全H级和田级实验室内,着装可简省至外科手术着装水平,即带一次性口罩、帽子、穿后开口的白在杂费要孝琪要素热点可使用一次性服装。用后高压灭菌。耐用服装也应定期高压灭菌。A.5 鼠疫生物安全操作规程间用紫外线照射消毒灭菌30mino A.5.2 进入鼠疫强毒实验区后A.5.3 进行细菌分离、培养或验室应在元菌罩中进行。A.5.4 工作之前,生物安全柜毒液的毛巾。A.5.5 进行细菌操作时,接种环A.5.6 稀释菌液时,将吸管插溶胶。A.5.7 切勿从吸管中打出最A.5.
11、8 实验中需使用酷、三A.5.9 离心时,应使用双盖平衡时不得有菌液渗漏到A.5.10 A.5.11 实验室中所需要的其裂,立即置消毒液中浸泡5mi日10min后更换。室应在生物安全柜中进行;普通实台面用消毒液灭菌,并铺放浸有消飞溅。次性打击菌液,避免产生气泡或气一次性塑料手套。总量低于最高容量一个刻度单位;毒。A.5.13 进行动物实验时,勿用于直接对接或拔开注射器和针头,以免划破皮肤或元意接种。A.5.14 切勿在空气中直接排放含有菌液的注射器内的气、泡,以免形成气溶胶。A.5.15 接种过的实验动物应该放在定期消毒、封闭式实验动物室内,并有明确的实验记录。A.5.16 每次操作规程结束后
12、,应清理工作面,普通实验室台面用消毒液,生物安全柜台面用75%乙醇抹拭。所有物品应该归位,关闭生物安全柜。A.6 污染处理及消毒A.6.1 强毒实验区内的各项工作记录和其他物品,需经消毒液浸泡或高压灭菌后,方可拿出实验室。A.6.2 实验用试管、吸管及其他器械,经消毒液浸泡24h,高压灭晤后,方可拿出实验室。A.6.3 细菌培养物、实验动物尸体及污物,经高压灭菌后,方可拿出实验室,进行进一步处理。5 SN/T 1280-2014 A.6.4 工作完毕,检查各仪器设备是否恢复零位或正常运行,做好使用记录。A.6.5 更衣顺序:在普通鼠疫强毒实验室内,工作结束后将于和脚(着穿胶靴和手套)在消毒液内
13、搜1 min3 mi口,然后在消毒间接上述相反顺序脱下(手术手套在偏衫后脱),头巾或白大衣高压灭菌,医用于术手套和纱布口罩用0.1%新洁而灭消毒,如用滤材口罩可用环氧乙皖密闭灭菌,面罩或眼镜用酒精棉球消毒。最后洗手并用75%乙醇棉球擦面部裸露部位,用3%棚酸水漱口后,方可离开实验室。A.6.6 民主疫实验室内,未经消毒的污水不应直接排入公共下水系统。A.7 意外事故处理A.7.1 一般实验室事故,如培养物跌落破碎等,立即在污染区域喷洒消毒液,待消毒液彻底渗透污染物后,再行清理。清理时特别注意避免破碎玻璃等锐利物体割伤皮肤。清理出来的污染物品尽早高压灭菌,清理后的场所再用消毒液及75%乙醇擦拭后
14、,方可重新开始工作。A.7.2 可能造成人身伤害的实验室事故,如污染物溅落在身体表面,割伤、烧伤、烫伤,感染动物咬伤等情况时,立即进行紧急处理:未破溃的皮肤表面用消毒液清洗,伤口以腆酒、酒精消毒,眼睛用无菌生理盐水冲洗:事故的情况报告实验室主任,根据感染鼠疫的可能,决定预防性使用链霉素或其他对鼠疫有效的抗生素,并对受伤害者进行隔离观察。判明确实感染鼠疫肘,按传染病防治法的规定报告。A.7.3 工作人员进入强毒区工作后,7日内发生不明原因咳嗽、发烧和可疑为鼠疫的症状,应及时向实验室主任报告,不得擅自到医院就诊。不能排除实验室感染时,按鼠疫进行隔离观察和治疗。只有在排除鼠疫感染情况下方可到医院就医
15、。6 SN/T 1280-2014 附录8(规范性附录)鼠疫的PCR技术检测B.1 导言PCR(聚合酶链式反应)技术是用分子生物学技术,在体外模拟生物体内环境,对特定的DNA进行体外扩增。用这样的方法对鼠疫菌进行检测,操作简单、快速、特异性强、灵敏度高。将这一先进的检验技术应用到国境口岸的鼠疫检测工作中,可以提高鼠疫诊断的准确性和灵敏度,提高口岸鼠疫监测水平,对国境口岸鼠疫检测的快速诊断有一定的实用性。B.2 设备和材料高速台式离心机;水浴锅:培养箱;p日计;双蒸水发生器;微波炉;匀浆器;微量取液器(10L、20L、100L、200L、1000L) ;PCR仪;电泳仪;凝胶成像分析系统或紫外线
16、透射仪。B.3 试剂自己制B.3.1 1 mol/L Tris 100 mL Tris 12.1 g双蒸水90mL,加盐酸5mL左右,调pH=8.0,再加双蒸水至100mL,高压灭菌。B. 3.2 0.5 mol/L EDTA 100 mL EDTA 18.6 g双蒸水90mL,加氢氧化纳约2g,在磁力搅拌器上搅拌,再用10mol/L氢氧化纳滴加调pH=8.0,再加双蒸水至100mL,高压灭菌。(EDTA在加入氢氧化铀、pH近8.0时才全部榕解)。B.3.3 TE( 1 0 mmoI/L Tris、1mmoI/L EDTA ,pH=8.0)100 mL 1 mol/L Tris(pH=8.0)
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