农业部1025号公告-13-2008 动物性食品中头孢噻呋残留检测高效液相色谱法.pdf

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1、ICS 67120B 45中华 人民共和 国国家标准农业部1025号公告一132008动物性食品中头孢噻呋残留检测高效液相色谱法Determination of Ceftiofur residue in animal tissuesby high performance liquid chromatography20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布前言-1范围-2规范性引用文件-3制样31样品的制备-32样品的保存-4测定方法-41方法提要或原理 42试剂和材料一43仪器和设备一44测定步骤-45结果计算和表述-5检测方法的灵敏度、准确度、精密度51灵敏度52准确

2、度-53精密度附录A(资料性附录) 高效液相色谱图牛奶部分1范围-2规范性引用文件3制样 4测定方法41方法提要或原理-一42试剂和材料43仪器和设备44测定步骤-45结果计算和表述5检测方法的灵敏度、准确度、精密度51灵敏度 52准确度53精密度-附录A(资料性附录) 高效液相色谱图目 次农业部1025号公告一1320081111111112344444566666667789999O农业部1025号公告一132008前 言本标准附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：汪霞、毕言锋、仲锋。本标准系首次发布的国家标准。农

3、业部1025号公告一132008动物性食品中头孢噻呋残留检测高效液相色谱法1范围本标准规定了动物性食品中头孢噻呋残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。本标准适用于猪、牛的肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中头孢噻呋残留量检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注El期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 112000标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则(ISOIEC Directives，Part

4、3，1997，Rules for the structure and drafting of International Standards，NEQ)GBT 6682分析实验室用水规则和试验方法3制样31样品的制备取适量新鲜或冷冻的空白或供试组织，绞碎并使均匀。32样品的保存-20以下贮存。4测定方法41方法提要或原理试料中残留的头孢噻呋与二硫赤藓醇(DTE)溶液共同培养，使头孢噻呋及去呋喃甲酰头孢噻呋(DFC)有关代谢物从蛋白或含硫化合物中分离，产生DFC。DFC与碘乙酰胺反应，生成稳定的DFC乙酰胺衍生物(DCA)，原形药或代谢物均转化为DCA衍生物。用c-s固相萃取柱对衍生物进行提取。强

5、阴离子交换(SAX)柱纯化，再用强阳离子交换(SCX)柱净化。DCA衍生物用高效液相色谱紫外法测定，外标法定量。42试剂和材料以下所用试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合GBT 6682规定的二级水。4 2 1头孢噻呋标准品：以C。H。，N。O，S。计，含量875。4 2 2乙腈：色谱纯。4 2 3甲醇。4 2 4二硫赤藓醇。4 2 5碘乙酰胺。42 6无水氯化钙。4 2 7冰醋酸。4 2 8磷酸：85。1农业部1 025号公告一1 320084 2 9氯化钾。4 2 10氢氧化钾。42 11磷酸二氢钾。4 2 12硼酸钾。4 2 13氯化钠。4 2 14氢氧化钠。4 2 15三氟乙酸。

6、4 2 16 005 toolL硼酸缓冲液：pH约为9：称取19 g硼酸和37 g KCl，加水溶解并稀释至1 000mL。4217 0025 molL磷酸缓冲液：pH-7：称取34 g KH2POa，加水溶解并稀释至1 000 mL，用45KOH调pH。4218提取液(o4DTE w口)：将1 g DTE溶于250 mL硼酸缓冲液中，现用现配。4219碘乙酰胺溶液(14w口)：将7 g碘乙酰胺溶于50mL磷酸缓冲液中，现用现配。4220 001 toolL氢氧化钠溶液：称取04 g NaOH，加水溶解并稀释至1 000 mL。4 2 21 01 toolL氯化钠溶液：称取59 g NaCl，

7、加水溶解并稀释至1 000 mL。4222 01toolL氯化钙溶液：称取n1 gCaCIz，加水溶解并稀释至1 000mL。4223 25磷酸溶液：取25 mL磷酸，加水溶解并稀释至100 mL。4 2 24 5醋酸溶液：取5 mL乙酸，加水溶解并稀释至100 mL。4 2 25 c18洗脱液：乙腈：水(15；85)。4 2 26 SAX预洗液：甲醇：01 molL氯化钠溶液(25：75)。42 27 SAX洗脱液：乙腈：5醋酸水溶液(5：95)。4228 SCX预洗液：甲醇：01toolL氯化钙溶液(25：75)。4 2 29 SCX洗脱液：乙腈：01 molL氯化钠溶液(5：95)。4

8、230 HPLC流动相：流动相A(01TFA水溶液)：取1mL三氟乙酸，加水至1 000mL。流动相B(01TFA乙腈溶液)：取1 mL三氟乙酸，加乙腈至1 000 mL。4 2 31头孢噻呋标准储备液(100“gmL)：称取盐酸头孢噻呋标准品约112mg，于100mL量瓶中，用磷酸缓冲液溶解并稀释至刻度，配成浓度为100 pgmL的贮备液；将贮备液移至冷藏安全瓶中，在一10贮藏，有效期6个月。42 32头孢噻呋标准液(100“gmL)：量取05mL头孢噻呋标准储备液，于5mL量瓶中，用磷酸缓冲液溶解并稀释至刻度。42 33头孢噻呋标准液(10“gmL)：量取05mL头孢噻呋标准液(100 p

9、gmL)，于5mL量瓶中，用磷酸缓冲液溶解并稀释至刻度。4 3仪器和设备431 高效液相色谱仪：配紫外检测器。432天平；感量001 g。4 33分析天平：感量o000 01 g。4 3 4恒温水浴振荡器。43 5匀浆机(10 000 rmin)。4 3 6漩涡混合器。2农业部1025号公告一1320084 3 7冷冻离心机。438固相萃取装置。439 pH计。4 3 10离心管：50mL聚丙烯管。4 311 CJ8固相萃取柱：1 g6mLVarianBondEluto。4，3，12 SAX固相萃取柱：500mg10mLVarianBondElut8。4 3 13 SCX固相萃取柱：100 m

10、g10 mL Varian BondEluto。：提及公司的信息及标识。除非做了说明，并不意味推荐使用该公司的产品。4 4测定步骤44 1试料的制备试料的制备包括：取均质后的供试样品，作为供试试料；取均质后的空白样品，作为空白试料；取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。4 4 2提取与净化4 4 2 1称取试料(2-005)g，加300 mL提取液，于振荡器中中速振荡5 min。取150 mL(相当于1_0 g组织)提取液，移至50mL离心管中，在转速为20 rmin30 rmin的5CC振摇水浴中培养15min。4 4 22衍生(生成去呋喃甲酰头孢噻呋乙酰胺)：每个

11、离心管中加3 mL碘乙胺溶液，混匀后，室温下放置衍生30 min。于4=C下10 000 rmin离心20 min。上清液转入另一离心管中，备用。4 4 2 3 C。固相萃取柱净化：依次用4mL甲醇和5mL磷酸缓冲液对C。s固相萃取柱进行预洗。在柱中加上清液，过柱。依次用5 mL磷酸缓冲液和3 mL 001 molL氢氧化钠溶液洗柱，挤干。加3 mLC-s洗脱液，收集洗脱液，用15 mL水稀释至总体积为18 mL，混匀。4 424 SAX固相萃取柱净化：依次用2 mL甲醇、2 mL SAX预洗液和2 mL水对SAX固相萃取柱进行预洗。在柱中加C。固相萃取柱的稀释提取液，过柱，用1mL水洗，挤干

12、。加3mL SAX洗脱液，收集洗脱液。加10mL水，使总体积为13mL，混匀。注：脂肪组织稀释提取液过SAX柱后，用1mL水洗，挤干。加20mL SAX洗脱液，收集洗脱液，混匀，供高效液相色谱进行分析。4425 SCX固相萃取柱净化：依次用1 mL甲醇、2 mL SAX预洗液和2 mL水对SCX柱进行预洗。在柱中加入SAX固相萃取柱的稀释提取液，过柱，用1 mL水冲洗。4426去呋喃甲酰头孢噻呋乙酰胺(DCA)衍生物的洗脱：在洗脱前，将SCX固相萃取柱挤干或真空中抽干。用20mL SCX洗脱液洗脱，挤干，收集洗脱液，混匀，供高效液相色谱分析。443标准曲线的制备精密吸取头孢噻呋标准工作液适量，

13、用0025toolL磷酸缓冲液稀释成浓度为006 pgmL、02pgmL、04 pgmL、20 pgmL、60 FgmL、100 pgmL，供高效液相色谱分析。4 4 4测定4 4 4 1色谱条件色谱柱：C18柱，250 mmX46 mm(id)，粒径5“m，或相当者；检测波长：266 nml柱温：30；流速：10 mLmin；3农业部1025号公告一132008进样量：40 ffL；流动相：A：01TFA水溶液；B：01TFA乙腈溶液。梯度程序(表1)：步骤0：为不同运行间平衡15 mJn；步骤1：为线性梯度至25B，时间为25 min步骤2：为立即转换为50B，时间为5 rain。表1步骤

14、 时间，rain A B 梯度曲线0 15 0 100 0 01 25 0 75 25 12 50 50 50 04 442测定法取适量试样溶液和相应的标准工作液，作单点或多点校正，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中头孢噻呋的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，标准溶液和试样溶液的色谱图见附录A中图A1、图A2。4 4 5空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。45结果计算和表述按式(1)计算试料中头孢噻呋的残留量(gkg)：X一CVlFx 2(1)y式中：x试料中头孢噻呋的残留量，单位为微克每千克(”gkg)；c试样溶液中头孢噻呋的浓度，单位为纳

15、克每毫升(ngmL)；vscx洗脱液的体积，单位为毫升(mL)；M一试料的质量，单位为克(g)。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。5检测方法的灵敏度、准确度、精密度5 f灵敏度本方法在肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中的定量限为100 rgkg，牛肝脏中的定量限为500 r,gkg。52准确度本方法在100 rgkg6 000 vgkg添加浓度的回收率为80110。5 3精密度本方法的批内相对标准偏差15，批问相对标准偏差15。4附录A(资料性附录)高效液相色谱图农业部1025号公告一132008mAU3 532 521510 5010 15 20 25

16、 皿“图A 1 0 5l培mL头孢噻呋标准溶液色谱图图A 2肝脏组织中添加500鹏,kg色谱图农业部1025号公告一132008牛 奶 部分1范围本标准规定了牛奶中头孢嚷呋残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。本标准适用于牛奶中头孢噻呋残留量检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注目期的引用文件，其最新版本适用于本标准。6BT 112000标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则(Is0IEC

17、 Directives，Part 3，1997，Rules for the structure and drafting of International Standards，NEQ)GBT 6682分析实验室用水规则和试验方法。3制样31样品的制备取适量新鲜或冷冻的空白或供试组织，并使均匀。32样品的保存一20以下贮存。4测定方法41方法提要或原理试料中残留的头孢噻呋与二硫赤藓醇(DTE)溶液共同培养，使头孢噻呋及去呋喃甲酰头孢噻呋(DFC)有关代谢物从蛋白或含硫化合物中分离，产生DFC。DFC在C。固相萃取柱中与碘乙酰胺反应，牛成稳定的DFC乙酰胺衍生物(DCA)，原形药或代谢物均转化为D

18、CA衍生物。再用强阳离子交换(SCX)柱进行净化。DCA衍生物用高效液相色谱一紫外法测定，外标法定量。4 2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GBT 6682规定的二级水。4 2 1头孢噻呋标准品：以C。H。，NsO，Ss计，含量875。4 2 2冰醋酸。4 2 3乙腈：色谱纯。424醋酸铵。4 2 5二硫赤藓醇。4 2 6碘乙酰胺。4 27甲醇：色谱纯。4 2 8氢氧化钠。42 9三氟乙酸。6农业部1025号公告一1320084 2 10 10molL醋酸铵溶液：称取771 g醋酸铵，加水溶解并稀释至1 000mL。4 2 11 01 molL醋酸铵溶液：称取7

19、71 g醋酸铵，加水溶解并稀释至1 000 mL。4 2 12 001 molL氢氧化钠溶液：称取04 g NaOH，加水溶解并稀释至l 000 mL。4 2 13 2醋酸溶液：取20mL醋酸，加水溶解并稀释至1 000 mL。4 2 14 2oDTE提取液：将100mgDTE溶于5mL 01toolL醋酸铵缓冲液中，用1toolLNaOH溶液调pH至89。检测中，每50mL牛奶样品需50mL提取液，现用现配。42 15 4o碘乙酰胺溶液：将200 mg碘乙酰胺溶于5 mL 01 molL醋酸铵缓冲液中，现用现配。4216 C，。洗脱液：乙腈：2醋酸溶液(20：80)。4 2 17 SCX洗脱

20、液：甲醇：10molL醋酸铵溶液(15：85)。4 2 18 HPLC流动相：流动相A(01TEA水溶液)：取1 mL三氟乙酸，加水至1 000 mL。流动相B(01TFA乙腈溶液)：取1 mL三氟乙酸，加乙腈至1 000 mL。4 2 19头孢噻呋标准储备液(100“gmL)：称取约盐酸头孢噻呋标准品约112 mg，于100 mL量瓶中，用01 molL醋酸铵溶液溶解并稀释至刻度，配成浓度为100 pgmL的贮备液。将贮备液移至冷藏安全瓶中，在一20贮藏，有效期6个月。4 220头孢噻呋标准工作液(50”gmL)：量取05mL头孢噻呋标准储备液，于10mL量瓶中，用01 toolL醋酸铵缓冲

21、液溶解并稀释至刻度。43仪器和设备4 3 1高效液相色谱仪：(配紫外检测器)。4 3 2天平：感量001 g。4 3 3分析天平：感量0000 01 g。4 3 4恒温水浴振荡器。4 3 5匀浆机(10 000 rrain)。436漩涡混合器。437冷冻离心机。438固相萃取装置。4 3 9 pH计。4 3 10离心管：50mL聚丙烯管。4311 C18固相萃取柱：1 g6mL Varian BondElut。4312 SAX固相萃取柱：500 mg10 mL Varian BondElut。：提及公司的信息及标识。除非做了说明，并不意味推荐使用该公司的产品。44测定步骤4 4 1试料的制备试

22、料的制备包括：取均质后的供试样品，作为供试试料；取均质后的空白样品，作为空白试料；取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。4 4 2提取与净化442 1量取50mL_+05mL牛奶样品于离心管中，每个样品中加50mL的DTE提取液，充分混合，在转速为20 rmin30 rrain的50。C振摇水浴中培养15 min。于4。C下10 000 rrain离心20 rain，7农业部1 025号公告一1 32008将上清液转入另一离心管中，尽鼍完全转移上清液(如上清液中有漂浮的固状凝结物，将其除去)，备用。4 4 22 C，s柱净化：依次用5mL甲醇、25mL 01molL醋

23、酸铵溶液进行预洗，保持湿润，待用。上清液过C，s柱，并确保溶液慢慢流出(必要时，可以采用真空或正压)。用5 mL 01 molL醋酸铵溶液洗涤两次，在柱上衍生化以前排干洗涤液。4 4 23柱上衍牛化(生成去呋喃甲酰头孢噻呋乙酰胺)：每个C。柱上加5 mL碘乙酰胺溶液，使溶液至少在30min内流完，保证衍生化反应充分进行。用5mL 01toolL醋酸铵溶液冲洗两次，再用5mL2醋酸溶液洗涤，保持湿润。4 4 24 SCX柱净化：依次用2mI。甲醇、2mL乙腈：2醋酸溶液(20：80)冲洗SCX柱。将C-s柱直接放在相应的SCX柱上，用23mLC。洗脱液，将C。柱上的衍生化物直接洗脱到SCX柱中，

24、使溶液以适当的速度慢慢通过SCX柱。4 4 2 5去呋喃甲酰头孢噻呋乙酰胺(DCA)衍生物的洗脱：依次用1 mL甲醇，2 mL 2醋酸溶液洗涤SCX柱，挤干柱子和接VI中的溶液。用20mL SCX洗脱液洗脱，收集洗脱液，混匀，供高效液相色谱分析。44 3标准曲线的制备精密吸取头孢噻呋标准工作液适量，用01 toolL醋酸铵溶液稀释成浓度为002 vgmL、005 pgmL、01 pgmL、03 pgmL、06 pgmL，供高效液相色谱分析。4 4 4测定4 4 4 1色谱条件色谱柱：C1。柱，250 mmX46 mm(id)，粒径5m，或相当者；检测波长：266 nmi柱温：30；流速：10

25、mLmin；进样量：40“L；流动相：A：(o1TFA水溶液)；B：(01TFA乙腈溶液)；梯度程序(表1)：步骤0为不同运行间用10B平衡10rain；步骤1为线性梯度至40B，时问为13 rain；步骤2为立即转换为60B，时间为2 min。表1步骤 时间，min A B 梯度曲线0 10 0 90 10 01 13 0 60 40 12 2O 40 60 O4 4 4 2测定法取适量试样溶液和相应的标准工作液，作单点或多点校正，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中头孢噻呋的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，标准溶液和试样溶液的色谱图见附录A中图A1、A2。44

26、5空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。4 5结果计算和表述8农业部1025号公告一132008按式(1)计算试料中头孢噻呋的残留量(“gkg)：X一罾式中：x试料中头孢噻呋的残留量，单位为微克每千克(pgkg)；C试样溶液中头孢噻呋的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；vSCx洗脱液的体积，单位为毫升(mL)；M试料的质量，单位为克(g)。注：汁算结果需扣除空白值，测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字5检测方法的灵敏度、准确度、精密度51灵敏度本方法在牛奶中的定量限为50“gkg。52准确度本方法在50”gkg200 pgkg添加浓度的回收率为80110。5 3精密度本方法的批内相对标准偏差15X，批间相对标准偏差15。农业部1025号公告一132008mAU1412108642O0附录A(资料性附录)高效液相色谱图4 of1CFAE_DCA f1u I一卜图A 1 0 21wJmL头孢噻呋标准溶液色谱图图A 2牛奶组织中添加200Bgkg色谱图0jiU42086420