GB T 24310-2009 烟草及烟草制品.转基因检测方法.pdf
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1、ICS 65160X 85 圆雪中华人民共和国国家标准GBT 243 1 02009烟草及烟草制品 转基因检测方法Tobacco and tobacco products-Detecting method of genetically modified organism contents2009-09-30发布 200912-01实施丰瞀髁鬻瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会促111GBT 243 102009目 次前言ll范围l2规范性引用文件13术语和定义l4实验室要求z5试剂36仪器设备37取样48烟叶样品DNA提取方法。49转基因烟草定性检测方法510转基因烟草定量检测“711转基
2、因烟草检测验证标准。812检测报告。9附录A(规范性附录)含EB电泳液的处理方法。10附录B(规范性附录)各类样品的DNA提取方法11附录C(规范性附录)DNA提取物的浓度和纯度的测定方法12附录D(规范性附录)烟草转基因检测PCR扩增体系与扩增条件13附录E(规范性附录)溶液的配制。14附录F(规范性附录)荧光定量PCR扩增体系与扩增条件16附录G(资料性附录)烟草转基因检测结果报告单18前 言GBT 24310一2009本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录,附录G为资料性附录。本标准由国家烟草专卖局提出。本标准由全国烟草标准化技术委员会(SACTC 144)归
3、口。本标准起草单位:中国烟草进出口烟叶检测站、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人:郭兆奎、陈枝南、冯茜、万秀清、颜培强、李丽杰、乔婵、孙宏宇。1范围烟草及烟草制品 转基因检测方法GBT 243102009本标准规定了烟草种子、鲜烟叶、初烤烟、片烟和卷烟烟丝进行转基因成分检测的样品取样方法和实验室检测方法。本标准适用于烟草及烟草制品转基因成分检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期
4、的引用文件,其最新版本适用于本标准。GBT 56061卷烟第1部分:抽样GBT 19616烟草成批原料取样的一般原则3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31转基因烟草genetically modified tobacco通过基因工程技术或现代生物技术改变基因组构成的烟草。32小样increment在一个取样单位一次取出的一定数量的烟草,构成单样的一部分。GBT 19616 2004,定义2633样品sample从一个群体中选取的一个或多个具有代表性的样本单位。34实验室样品laboratory sample用于实验室检验或测试的样品,其代表总样。GBT 19616 2004,定义2103
5、5检测样品test sample实验室样品经过研磨和匀浆(如果需要)处理后进行分析测定的样品。36聚合酶链式反应扩增polymerase chain reaction amplificationPCR扩增模板DNA序列在含有4种脱氧核糖核酸(dNTPs)、引物、DNA聚合酶等的反应体系中,在仪器中通过多次的高温变性、退火和延伸的循环过程,最终使目标DNA片段以几何倍数扩增。】GBT 24310200937巢式PCR nested PCRPCR扩增过程中,首先用一对外引物进行第一轮PCR,然后以第一轮PCR扩增产物为模板,使用第一对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增。38半巢式PCR s
6、embnted PCRPCR扩增过程中,首先用一对外引物进行第一轮PCR扩增,然后以第一轮PCR扩增产物DNA傲为模板,使用该模板DNA序列内部的一个引物及第一轮扩增中的一条外引物进行第二次PCR扩增。39实时定量PCR扩增realtime PCR amplification在PCR反应体系中加入荧光探针或荧光染料,利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。310看家基因housekeeping gene细胞或生物体整个生命过程中都持续需要而且必不可少的组成型表达基因。311阳性对照样品positive control sample经鉴定为含有检测目标成分
7、的对照烟草样品。312阴性对照样品negative control sample经鉴定为不含有检测目标成分的对照烟草样品。313试剂对照样品reagent control sample检测过程中与样品一起进行各种检测操作的试剂参照样品。3。14提取空白对照样品extraction blank control sample样品DNA提取过程中放置在操作区内的开盖的空白参照样品。315特异性specificity特异地检测某种物质,并可将其与相似物质、杂质或降解物分辨开来的能力。4实验室要求41样品重复检测每个待测样品随机分成两份,每份单独进行DNA提取和PCR分析。42对照样品每次试验中均设置阳
8、性对照、阴性对照、试剂对照及提取空白对照。在定性检测时选用01阳性作为阳性对照;定量检测时设置01、05、1o、2o、5o oA阳性对照建立标准曲线。43防止污染样品准备、样品前处理、DNA提取、PCR反应液加样、PCR扩增和电泳与凝胶观察等操作在相互隔离并具有100外排风的不同操作间中进行,并设置紫外灯,操作前后进行空间过夜照射。样品研磨在强力通风橱中进行,每个样品更换一次塑料手套;样品的称量应设专用天平,不可在称量试剂的天平室内进行;用于提取DNA和PCR扩增的耗材、用具使用前都应进行灭菌处理,tip头和各种离心管一次性使用。2GBT 24310200944安全防护整个试验操作过程中必须穿
9、着工作服和佩戴手套,特别在接触EB时应带抗化学腐蚀的手套及口罩。45有毒废弃物处理451含EB的电泳液处理方法见附录A。452含EB的凝胶含有EB的废凝胶暂存于广口瓶中,定期放人生物危害焚烧炉中进行焚烧处理。5试剂除非特别说明,检测中仅使用分析纯化学试剂和超纯去离子水,PCR反应体系用水应使用电阻率为182 Mncm以上的超纯水。各种缓冲液均冷藏于4冰箱,各种酶和抗生素母液冻存于一20以下冰箱。51 十二烷基硫酸钠(sDs)。52 乙二胺四乙酸钠(EDTA)。53十六烷基-Z甲基一乙基一溴化铵(CTAB)。54 Tris碱。55 Tris-HCl。56聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。57液氮。58三
10、氯甲烷。59异戊醇。510 2一巯基乙醇。511乙醇。512硼酸。513氢氧化钠。514琼脂糖。515溴酚蓝。516二甲苯青FF。517溴乙锭。518冰醋酸。519溴乙锭(EB)。520 NaCl。521 MgCl2。522 DNA聚合酶。523 10XPCR缓冲液。524尿嘧啶DNA糖基酶(uNG酶)。525 dNTPs液(dATP、dCTP、dGTP各25 mmolL,dUTP 5 mmolL)。526 DNA标准分子量。527限制性内切酶(Xmnl、EcoR V、NsiI)。528 SYBR Gteen I染料。6仪器设备61 PCR仪(控温精度士03)。3GBT 24310一20096
11、2紫外分光光度计(波长精度03 nm)。63荧光定量PCR仪(控温精度士04)。64电泳系统(50 V600 V,10 mA400 mA)。65紫外分析仪(检测灵敏度:Proteino02 ng DNAo05 ng)。66恒温水浴锅(精度土01)。67高速冷冻离心机(最大离心力30 0009)。68微量离心机(最大离心力20 0009)。69 pH计(精度002 pH或士2 mA)。610分析天平(感量0000 1 g)。611超低温冰箱(一40一86)。612 微量移液器(10 pL、20 pL、50 pL、100 pL、200 ItL、1 000弘L,精度o810)。613超纯水器(电阻率
12、182 Mncm)。614磁力搅拌器(转速02 000 rrain)。615超净工作台截流效率:99999 9,层流风速:045 ms(90 fpm)。616恒温干燥箱(30300,温度波动士1,控温精度士1)。7取样71种子以品种和种子产地为取样单位,即每个品种作为一个样品,对虽为同一品种,但供种单位(种子产地来源)不同,也作为单一样品取样,每一样品随机多点取样10 g,样品编号注明品种名称、种子产地。72鲜烟叶鲜烟叶样品在田间取样,以品种和种子产地为取样单位随机取样,每个样品在10个不同地块各取一个嫩芽或叶片,编号注明品种名称、种子来源、取样地点、取样单位、取样人、日期等信息,自然失水2
13、d后放人塑料袋中。73初烤烟以检验批为单位,每检验批的产地和等级应是相同的,50件以下随机选2件各取1个小样,5l件100件取4个小样,101件150件取5个小样,151件200件取6个小样,200件以上每增50件(不足50件按50件计)增取1个小样,各小样混合后用四分法缩分出均匀样品2份(每份250 g)作实验室样品供检验和复检,实验室样品应密封并填写标签,注明产地、等级报验号、送样单位、取样人。74片烟对于已装箱的片烟,以箱(内装100 kg烟叶)为取样单位,用长筒状取样器,每箱随机取约2 g烟叶,将每个集装箱的99箱烟叶所取的近200 g烟叶作为一个检测样品;也可在复烤加工车间,结合水分
14、测定取样,注明烟叶产地、等级和箱号、取样地点、送样单位和取样人。75卷烟按照GBT 56061中规定的方法进行卷烟抽样。8烟叶样品DNA提取方法81样品前处理811种子随机取烟草种子样品放人装有滤纸保湿的培养皿中,28光照下培养7 d,用滤纸吸出表面水分,称种子萌发幼苗质量约900 mg,在灭菌的研钵内加液氮研磨呈粉末,分别装入3个已知质量的15 mL离心管中,再称量,置-20冰箱中储存备用。4GBT 243102009812鲜烟叶随机取鲜叶样品约900 mg,在研钵内加液氮(57)研磨成粉末,转入称量的3个15 mL离心管中,称量确定叶片组织质量。813烤后烟叶随机取烟叶样品约20 g,用硫
15、酸纸包好,置方盘加盖后,40恒温干燥箱(616)中过夜使其干燥,在灭菌的研钵中研成粉末,存于20 mL离心管中,从中取约60 mg分别放入两个15 mL离心管中。814卷烟随机取卷烟50支,去除卷烟纸、滤嘴,将烟丝按81-3方法前处理。82 DNA提取方法见附录B。83 DNA产量和纯度测定方法见附录c。9转基因烟草定性检测方法首先进行共有序列标志的PCR扩增,再通过巢式PCR、限制性内切酶酶切和目的基因序列扩增方法进行验证,确定所转目的基因的种类。91共有序列标志的PCR扩增911 PCR引物用于转基因烟草检测共有标志主要有:花椰菜花叶病毒35S启动子、根癌农杆菌rlOS终止子和编码卡那霉素
16、抗性基因(NPTII),根据这些核甘酸序列设计PCR引物进行烟草转基因检测。9111 35S启动子序列扩增35S-1:5CTACAAATGCCATCATTGCG 335S-2:5GGGTCTTGCGAAGGATAGTG 3该引物的扩增片段长度为205bp,作为转基因烟草检测的标志,确定花椰菜花叶病毒35S启动子序列的存在。9112 IIOS终止子序列扩增NOS_1:5GATTGAATCCTGTTGCCGGT一3NOS_2 1 5GTAACATAGATGACACCGCG一3该引物的扩增片段长度为213bp,作为转基因烟草检测的标志,确定来自根癌农杆菌的终止子序列nos的存在。9113 NPTII
17、基因序列扩增NPT一1 15GCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGC一3NPT-2 15GCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGA一3该引物的扩增片段长度为411bp,作为转基因烟草检测的标志,确定卡那霉素抗性基因NPTII序列的存在。912 PCR扩增体系见附录D。913 PCR扩增条件见附录D。914电泳及凝胶观察称琼脂糖(514)溶于05倍TBE缓冲液(第E10章)中,制成15凝胶,加EB(05 pgmL),待温度降至55左右时倒入放有梳子的凝胶模具中,冷凝后拔出梳子。放入水平电泳槽中,取10 pL扩增产物加溴酚蓝上样缓冲液(第E1l章)点样,加DNA标准分子量标记
18、(526)电泳(64),紫外分析仪(65)观察电泳结果。5GBT 24310200992特异性基因序列的PCR检测在烟草上进行过转基因研究的主要有烟草普通花叶病外壳蛋白基因(TMV-cp)、黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因(CMVcp)、马铃薯Y病毒外壳蛋白基因(PVY-cp)、TMV和PVY病毒复制酶基因和苏云金杆菌杀虫蛋白(BT)等基因,根据这些目的基因序列,设计引物用于阳性样品的目的基因鉴定。921 烟草普通花叶病外壳聋白基因TMV-epTMVl 5一GTGTTCTTGTCATCAGCGTGGGC一3TMV2 5一CACCGTTGCGTCATCTACTCTACG一3其PCR扩增产物片段长度为32
19、7bp。922黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因CMV-cpCMVl 5一ACCCAACCTTTGTAGGGAGTGAGCG一3CMV2 5一ACATAGCAGAGATGGCGGCAACG一3其PCR扩增产物片段长度为264bp。923马铃薯Y病毒外壳蛋白基因PVY-cpPVYl 5一GATATTTCAAATACTCGGGCA一3PVY2 5一GCATAACGCGCTAAACCCAT一3其PCR扩增产物片段长度为362bp。924 TMV复制酶基因TMV54KDT54D1 5一GAGTTGTCTGGCATCATTGA一3T54D2 5一ACAATGGTCAAAGCCGGGTA一3其PCR扩增产物片段长度
20、为296bp。925 PVY复制酶基因PVY-nibPVY nibl 5一GCTCCGGTGTAAGGAGAAGA一3PVY nib2 5一GtGAGCCATCAGCATCACAG一3其PCR扩增产物片段长度为230bp,926苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt-cryIA(c)BTl 5一CAGTTTCTGCTCAGCGAGT一3BT2 5一GCTGAGGTGAAGATTAGCTG一3其PCR扩增产物片段长度为381bp。927黄瓜花叶病毒微卫星RNA CMVsat RNACMVsatl 5一CTGCGTGATGATCCTTCACT一3,CMVsat2 5一TTCACGGAGATCAGCATAGC一
21、3其PCR扩增产物片段长度为322bp。928豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTIcptil 5一TTGCTTGAACCACCTCGGAACT一3cpti2 5一CTTGCCTGGCATTGATCGTGTA一3其PCR扩增产物片段长度为196bp。929草甘膦耐药基因EPSP(5-烯醇丙酮酰一莽草酸-3-磷酸合成酶)EPSPl 5一tccagccatccgcgaacaag一3EPSP2 5一agcagcggcggaatcagcat一3其PCR扩增产物片段长度为265bp。上述各种引物(921929)PCR扩增体系和条件见附录D。93结果验证试验对于35S启动子和nos终止子序列引物的PCR扩增均未出
22、现阳性条带的样品,进行巢式或半巢式6GBT 243 1 02009PCR扩增,以提高检测的灵敏度,若仍没有扩增产物,可确定该样品为阴性,不含转基因烟草成分;对于35S启动子和(或)nO$终止子序列引物的PCR扩增同时或有一种出现阳性条带的样品,重新提取DNA,重复前述PCR检测排除污染,同时进行巢式PCR扩增和限制性内切酶酶切反应排除非特异性扩增的可能。931巢式或半巢式PCR反应验证将第一次扩增的产物(引物为35S-I和35S-2或NOS-1和NOS-2)2超纯水稀释i00倍,取1 pL作为第二次扩增的DNA模板,以下列引物进行第二次扩增,扩增体系与扩增条件见附录D。9311 35S巢式PC
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