SN T 1611-2005 南方菜豆花叶病毒血清学检测方法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1611-2005 南方菜豆花叶病毒血清学检测方法Serological detection method of southern bean mosaic sobemovirus 2005-08斗8发布060608000122 2006-02-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检菇总局乞旬中华人民共和国出入境检验检疫行业标准南方菜蓝花叶病毒血清学检测方法SN/T 1611-2005 当毛中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷A 开本8

2、80X1230 1/16 印张O.5 字数8千字2005年11月第一版2005年11月第一次印刷子书号:155066 2-16457 定价6.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533前言本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人:陶魔典、朱水芳、易建平、杨翠云、印丽萍、朱伟祖。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1611一2005I SNjT 1611-2005 南方菜豆花叶病毒血清学检测方法1 范围本标准规定了南方菜豆花叶病毒的DAS-ELISA检测方法。本

3、标准适用于豆科作物种商中南方菜豆花叶病毒的检测。对于检测豆科作物种子中的南方菜豆花叶病毒时，其种子须经发芽或种植并形成小苗后再进行检测。2 缩略语下列缩略i吾适用于本标准。2.1 DA8-ELISA:双抗体夹心ELISADouble antibody sandwich ELISA。2.2 PBS:磷酸盐缓冲液Phosphate Buffer Saline o 2.3 10XPBS:10倍浓度的PBS母液。2.4 PBST:含Tween-20的PBS。2.5 SEB:样品拍提缓冲液Sample Extraction Buffer 0 2.6 CB:包被缓冲液Coating Buffer。3 病毒

4、概述3. 1 瘸毒学名Southern bean mosaic virus，缩写:SBMVo3.2 病毒粒体等轴对称的二十面体，直径约30nmo 3.3 捕毒分类属于南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)，是该属的典型成员:尚未划分到特定的科。3.4 病毒稳定性体外存活期:180C 220C下20d165 d，稀释限点:10-5 10-8，致死温度:900C 95 oC (10 min)。3.5 自然寄主主要是豆科作物中的菜盟和虹盟。3.6 分布发生在美洲和非洲的温热带地区，法国和亚洲的印度也有报道。3. 7 传播主要通过豆科作物的种子进行远距离传播。3.8 血清学特性病毒具有极强的免疫

5、原性，抗体效价:1: 2 0481 : 4096(微量沉淀法)。免疫电镜法和ELISA方法适合于组织汁被中病毒的检测。3.9 株系南方菜豆花叶病毒分为8株系CBeanstrain)、C株系(Cowpeastrain)、G株系(Ghanastrain)、M株系(Mexicanstrain)等，但各株系之间存在密切的血清学关系，因此不会因为所使用的抗血清是来自于不同株系而产生漏检的情况。4 仪器或器具4. 1 酶联板。7气字工万亏骂苦?三二飞宇SN/T 1611-2005 4.2 可调式移液器(2.5L、10L、100L、200L、1000L各一支)及相应吸头。4.3 12孔道200L可谓式移液器

6、及吸头。4.4 酸度计。4.5 调温水浴锅或调温培养箱。4.6 ELISA洗板机可选。4. 7 酶标仪。4.8 微量样品榨汁机(无微最样品榨汁机时，可用研钵进行手工研磨制样)。4.9 量筒(10mL、20mL、50mL、100mL、500rnL , l 000 mL各一个)。4. 10 分析天平精度1/10 000 go 4. 11 试剂瓶(10rnL、50rnL、100mL、500rnL、1000 mL各两个)。4.12 封口膜。4. 13 吸水纸。5 试剂、溶液及生物制剂本标准中所有化学试剂除特别说明外其纯度均为分析纯，实验用水至少是蒸锚水。5.1 10XPBS磷握盐缓冲谊氧化铀(NaCl

7、)81. 8 g 氧化饵(KCD1. 49 g 磷酸二氢梆(KHzP04)2. 72 g 磷酸氨二铀(Naz丑P04.2H2) 14.2 g 加水定容至1L。5.2 PBS磷酸融缓冲液10XPBS 7( 调节pH至7.4后再用水定容至1L。5.3 PBST洗板缓冲液100 mL 850 rnL 在PBS中加入Tween-20，使丁W巳en-20的浓度为0.1%(体积比)。5.4 S览B样品抽提缓冲液在PBS中加入以下试剂配制SEB:PVP(终浓度为2%，PVP即聚乙烯毗咯烧罔)卵清蛋白(终浓度为0.2%)Tween-20(终被度为0.05%) NaN3(终浓度为0.05%)。5.5 CB包被缓

8、冲液碳酸纳(NaZC03) 碳酸氢铀(NaHC03) 叠氮化纳(NaN3) 水调节pH至9.6后再用水定容至1L5.6 ELISA底物5.6. 1 底物缓冲溜1. 59 g 2.94 g 0.50 g 900 mL 用水将二乙薛股配制成10%浓度(体积比)，pH值元须调整。2 SN/T 1611-2005 5.6.2 底物的配制用0%土乙薛腊梅液将对硝基苯磷酸配制成1mg/mL的战度(现配现用)。5. 7 包被IgG纯化的南方菜豆花叶病毒抗体IgG，使用国内外正式注册的商品，包被时，根据供应商的说明用包被缓冲液CB稀释为工作浓度。5.8 酶析、抗体用碱性磷酸酶标i己的南方菜蓝花叶病毒的酶标抗体

9、，使用国内外正式注册的商品，检测时，用SEB稀释为工作浓度。6 样品制备6.1 阳性对照样品南方菜豆花叶病毒的纯病毒或者病组织抽提液，由抗血清供应商提供，用SEB制备。6.2 阴性对照样品由抗血清供应商提供.用SEB制备。6.3 空白对熙、用SEB作空白对照。6.4 待剧样品的制备6.4. 1 待检测的样品为小苗时，将幼嫩叶片l片2片，用SEB(样品与SEB的比率为1: 10左右)作为提取琅用微量样品榨汁机进行榨汁，无微量样品榨汁机时.手工研磨，所得汁被直接用于检测。6.4.2 待检测的样品为种子时，将种子发芽后再进行检测，播种的数量不少于100株。操作:用3%次氨酸纳对种子进行表面悄毒约10

10、min，无菌水洗三次，放在用湿润的吸水纸铺成的培养皿或瓷盘内，于室灌下培养直至种子发芽长出真叶，其时间根据豆科种子的不同一般l周左右;或者将种子在巳消毒的土壤内种植，待长出小苗后再进行检测。7 检测步骤7.1 用CB将南方莱豆花叶病毒的抗体IgG根据供应商的说明稀释到工作浓度后，按每孔100L的量包被酶联板。7.2 对自每联板进行封盖，37C下放置1h或4C冰箱过夜。7.3 按每孔200L的童用PBST洗板四次，每次1min , 7.4 按每孔100L的重加入待测样品，必须设立阳性对照、阴性对照和空白对照。并且待测样品、阳性对照、阴性对照和空白对照各至少有一个重复。7.5 对酶联板进行封盖，3

11、7C下放置1h或4C冰箱过夜。7.6 按每孔200L的量用PBST洗板四次，每次1min。7. 7 按每孔100L的量加入工作浓度的南方菜豆花叶病毒的酶标抗体。酶标抗体的工作浓度应根据供应离的要求用SEB进行配制。7.8 对酶联板进行封盖，37C下放置1h或4C冰箱过夜。7.9 按每孔200L的PBS丁洗板四次，每次1mino 7. 10 将底物按每孔80L的量加入到酶联板，370C显色30min60 min后，每孔加入50L3 mollL 的氮氧化铀或者50L1 mol/L的硫酸终止反应。7. 11 用酶标仪于405nm处测定吸光值。8 结果判定将反应结果用酶标仪于405nm处读数，当样品的吸光值P大于0.25、阴性对照的吸光值N小子山OONiFF户同Z的SN/T 1611-2005 O. 1且P/N大于2.0时，判为阳性，否则判为阴性。样品保存对于检测结果为阳性的样品，必须对样品进行保存。当样品为种子时，将样品保存在40C冰箱内;当样品为种苗时，应将样品用SEB制成汁液，装入塑料样品管内或者离心管内于-800C温度下保存以备复查。9 侵权必究伽DmA啥血。b叫去mnum dm 号一价书一定6.00元可版权专有SN/T 1611-2005