NY T 727-2003 饲料中呋喃唑酮的测定.高效液相色谱法.pdf

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1、NY/T 727-2003 前本标准修改采用ISO14797 :l999(E)(高效液相色谱法测定饲料中峡喃略阁含量以英文版)。本标准根据ISO14797 :l999(E)重新起草。考虑到我国国情和实验室设备状况，在采用ISO14797 , 1999(E)时，本标准做了一些修改。有关技术性差异和编辑性修改已编入正文中并在它们所涉及的条款的页边空白处用垂直单线标识。在附录B中给出了这些技术性差异及编辑性修改的一览表以供参考。本标准的附录A、附录B均为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国饲料标准化技术委员会归口。本标准负责起草单位z国家饲料产品质量监督检验中心(北京)，参加起

2、草单位z农业部饲料工业中心。本标准主要起草人z闰惠文、杨曙明、赵小阳、王彤、杨文军。I NY/T 727-2003 饲料中贱喃瞌酣的现ig: 高效掖相色谱法1 范围本标准规定了高效液相包谱(HPLC)法测定配合饲料、预混合饲料及浓缩饲料中峡喃盼阔的方法。本标准可用于含10mg/kg-5 000 mg/kg咬嚼瞠酶的自己合饲料和含最为0.5%-20%的预混合饲料及浓缩销料。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单不包援基主误的内容)或修订版均不适用于本标准，然丽，鼓励樱据本标准达成协议幸亏各方研究是否可使用这些号文件的最新版本

3、。凡是不注目期的引用文件，其最新版本适用于本标准GGB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699.1 饲料采样方法3 原理配合饲料以少量水湿润，用乙睛和甲醇的混合液将映哺嗖嗣提取出来，预混合饲料和浓缩饲料直接用乙腊和甲醇的i铝合液将映喃略酬提取出来，提取液经氧化铝短柱净化，用稀释液稀释后在反丰jj-HPLC上分离，紫外检测器365nm处测定。4 试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为优级纯或色谱纯的试剂。4. 1 水s符合GB/T6682级用水的规定。4.2 提取弗IJ，乙满2甲醇=110充分混匀，使用前放至2辈革主。4.3 稀释剂:将350mL提取剂(4.2)与6

4、50mL水(4.1)混合。4.4 10%乙酸溶液g将10mL冰乙酸用水稀释至100mL. 4.5 乙酸纳缓冲液，c(CH，CO，Na)=O.01 mol!L , pH=6. O. 用约700mL水溶解。.82g乙酸苦由，Jij乙盖章滚滚(4.4)将pH满至6.0，加水稀释3至1000mL争混匀。4.6 HPLC流动相:取800mL乙酸纳缓冲液(4.5)和200mL乙脯，混合均匀，通过O.2m的滤膜过滤，用前超声脱气10min。4.7 峡喃略自目标准物，N-(5硝基2峡暗!jl叉斗时氨基2-略陪是:妓酿e注意z离子奇主稽建黯对光十分敏感.黯苦苦续作都应在遂光条件下操作，擦伟对还应避免吸入、接触有

5、霉的政晴睡翻标准物和溶液.配制溶液要在通凤橱内进行，工作注意带眼镜、穿工作服防护。4.8 峡喃瞠酬贮备液(约250g/mIjz称取25mg士1mg峡喃瞠隅标准物(4.7)，准确至0.1mg，用提取液(4.2)溶解，稀释至100mL，混匀，贮于OC-8C冰箱中a计算溶液浓度时要t入标准物的纯度。滚滚有效郑个另。4.9 唉喃喽翻工作液约5在ImL和12.5仰ImL)，准确吸取2.0mL和5.0mL贮备液(4.8)分别置于100mL容簸瓶中，加65mL水，用提取液(4.2)稀释至刻度并混匀，每批样品均需制备新鲜的工NY/T 727-2003 作液。4. 10 中性氧化铝，活度l(对于全去活的氧化铝可

6、有O%l%的水)。处理方法如下:将中性氧化铝(100目200目放入马福炉，于550C灼烧3h.移至干燥器中冷却，装入密封容器中保存。5 仪器设备常用的实验室仪器设备，特别是下述仪器设备z5.1 pH计(带温度补偿，精确至0.01)05.2 溶剂过滤系统，全玻璃滤器，孔径。2mo5.3 超声水浴。5.4 振荡器，水平方向振荡，频率250r/min300 r/min。5.5 过滤装置，使用中速滤纸。5.6 玻璃纤维。5. 7 玻璃层析柱，长30cm，内径10mm，末端缩小能放置玻璃毛。5.8 过滤系统，能安放孔径为0.2m聚二氟乙烯(PVDF)或聚囚氟乙烯(PTFE)滤膜。5.9 HPLC系统，由

7、下述部件组成:5. 9. 1 泵，元脉冲，能将流速保持在O.1 mL/min2. 0 mL/mino 5.9.2 进样系统，进样环体积20L50Lo5.9.3 UV检测器，适合在波长365nm测定。如可能可使用二极管阵列检测器，其还能用于映喃瞠阁的确证。5.9.4 记录仪。5.9.5 保护柱:长20mm，内径3.9mm，填有粒度为37m100m的C18键合硅胶或质量相当的其他保护柱。5.9.6 分析柱z柱长200mm，内径3.0mm，填有粒度为5m的键合硅胶的C18柱或性能相当的其他分析柱。分析柱的性能应确保以下条件=峡嘀瞠固的容量因子K注1，注容量窗子的计算式。), KF ZR 一一-2 式

8、中K 容量因于gt, 咬喃唾固的保留时间，单位为分钟(mn); t一一不保留成分的保留时间，单位为分钟(min)曰5. 10 微量注射器。6 试样制备. ( 1 ) 按GB/T14699. 1采集实验室样品。将实验室样品(通常500g)粉碎，使之全部通过1mm筛，充分混匀。贮于磨口瓶中备用。7 分析步骤7. 1 一彼要求每次测定均应平行进行空白样品、空白添加样品的测定，如果可能还要进行参比样品的测定。注意空白样品是一些峡喃唾酣含量小于10mg/同样品的均匀混合物，空白添加样品是添加了峡2 NY/T 727-2003 喃喽酶的空白样品。空白样品和参比样品在0C8C下可贮存一年。如测得的添加回收率

9、小于94%或大于106%.分析应重新进行。7.2 空白添加样晶的制备添加样品中峡喃瞠酣含量应与测试样品中预期的峡喃嗖罔含量相当。和j备方法如下例欲制备一个映喃瞠酣含量为250mg/kg的添加样品，准确吸取5.0mL峡喃瞠酣贮备液(4.8)置于250 mL三角瓶中，用氮气吹至剩约0.5mL.加入5g空白饲料样品，充分混匀，放置至少10min，然后再做提取。7.3 提取称取适量制备好的试样，置于适当的三角瓶中，准确加入一定体积(如需要)的水，混合后放置5 min，准确加入提取JfiJ(4.2).盖好盖子，置于回旋振荡器上剧烈振摇30min，用过滤装置(5.5)过滤，滤液按7.4规定进行柱层析。用稀

10、释液(4.3)稀释滤液，使最后溶液中峡喃瞠酣含量达5g/mL10g/mL。充分混匀，用过滤系统(5.的过滤，滤液按7.5所述进行HPLC分析。具体提取条件见表1 表1样品中峡喃哇酣含量称样量水/mL提取剂/mL10 mg/kg2 500 mg/kg 5 g土50mg 15.00 35.0 2 500 mg/kg 5 000 mg/kg 5 g土100mg 30.0 70.0 o. 5%7% 1 g土50mg 100.0 7%10% 1 g土10mg 200.0 10%-20% 0.5 g士5mg 200.0 7.4 柱层析每个样品提取液，需用一根干法填充的玻璃层析柱。该玻璃层析柱下端放入一小团

11、玻璃纤维(5.们，上面填有4g中性氧化铝(4.10)。向柱中加入20mL根据7.3制备的样品提取液，弃去最初的4 mL流出液，用刻度试管收集随后的8mL流出液。必要时，将流出液用稀释剂(4.3)稀释，使映喃哇酣含量达5问/mL10g/mL.稀释倍数为1.用过滤系统(5.8)过滤，滤液按7.5所述进行HPLC分析。7.5 HPLC分析7.5. 1 色谱条件a) 流动相流速，0.6mL/min; b) 进样量.20L;c) 检测波长，365nm. 7.5.2 分析程序7. 5. 2. 1 向HPLC分析仪中连续注入峡喃嗖酣工作液(4.川，直至得到基线平稳，峰形对称而且峰高或峰面积能够重现的峡喃瞠酣

12、峰，即三个连续测定的峰高或峰面积中最大与最小值间的差异小于其平均值的5%。峡喃噬酣峰应是对称的(/.2)。注:fao为峡喃嗖酣峰峰高10%处，尾半部峰宽与前半部峰宽之商。两个峡喃瞠酣工作液所得色谱峰峰高与浓度间应有正比例关系，如果偏差大于5%，则需制备新的工作液。注入空白样品和添加空白样品的提取净化液，如果峡哺瞠酣峰形不对称或不能与基质中的杂峰分开，需更换分析柱或改变流动相中有机相与水相的比例。依次注入峡喃瞠酣工作液(4.9)、五个样品提取(净化)液和峡喃瞠酣工作液(4.9) .观察工作液的峰NY /T 727-2003 高或峰面积差异不得超过均值的5%。可依此顺序不断加入待测样品。7.5.2

13、.2 如果测得的峡嘀噬酣含量明显低于预期值，贝IJ需用比7.3所列体权多50mL提取液(4.2)重新提取样品并上机分析。如果新的分析结果较前一结果高出15%以上，则需用再多50mL的提取液(4.2)重新提取样品并上机分析，如此重复，直至两次测定的结果差异小于15%为止。8 确证8. 1 总则如果从峰形、测定数值对峡哺瞠酣的峰产生了怀疑，或所测定峡喃哇嗣含量低于25mg/kg，则必须用重叠色谱分析(8.2)或二极管阵列检测器(8.3)来确证。8.2 重叠色谱法于样品提取液中加入适量的吱喃瞠酣工作液(4.9) ，加入的量应与提取液中峡喃睡酶的量相当。依次注入样品提取液、峡喃瞠隅工作液和添加了峡喃峰

14、回的样品提取液。如果添加提取液样品峰的半峰宽变化不大于10%，且峰高或峰面积发生了成比例的变化，则可确证原峡喃瞠嗣峰就是峡喃略目同的。8. 3 二极管阵列检测器8. 3. 1 条件测定条件同7.5. 1的规定，只是将uv检测器换为二极管阵列检测器，具体参数如下参数设定测定波长频带宽度参比波长参比频带宽度光谱范围光谱值8.3.2 步骤365 nm 4 nm(即波长365士2nm) 450 nm 100 nm 225 nm400 nm 基线、峰最大值、上升斜率和下降斜率拐点日PLC系统稳定后，依次注入5问/mL的映喃哇酣工作液(4.川、有疑问的样品提取液和又5g/mL的峡喃嗖酣工作液(4.的。记录

15、、存储各个色谱峰的基线、最大值以及峰两侧的拐点数据。8.3.3 评价将样品峰不同光谱值(样品基线)归一化并绘制成图，记录峰值和峰前后的拐点值。分别将样品峰光谱和映喃盹隅工作液的光谱归一化，并绘图。在峰顶处标示。8.3.4 确证标准样品峰只有满足下述条件，才能证实是峡喃噬酣2a) 样品峰的保留时间应与标准峰的保留时间相同(差异土5%)，如有怀疑，需做标准物添加(即将标准物加到样品中)实验。b) 样品峰的纯度评定是基于所记录的峰顶、上升斜率拐点和下降斜率拐点不同光谱的符合程度。所有光谱图每个波长的相对吸收值应该相等(差异15%)。c) 波长大于220nm、样品光谱图与标准光谱图在相对吸收至少等于1

16、0%的部分无明显区别，样品峰和标准峰的最大吸收波长相同，即其差异不大于检测系统分辨率决定的范围(一般是2m4 nm)，两个光谱图任一观察点的偏差均不能超过该特定波长下标准测定物吸收值的15%。9 结果计算样品提取液中峡喃瞠酬的含量是通过比较样品提取液色谱峰的峰高或峰面积和在样品前后注人的峡喃瞠酣工作液的峰高或峰面积的平均值而计算出来的。9. 1 峡喃瞠酣含量为10mg/kg5 000 mg/kg的样品:配合饲料样品中映喃瞠酣的含量W可用式(2)计算Wf z J1xcs互XfrL m 式中=W, 试样中峡喃嗖酣的含量，单位为毫克每千克(mg/kg); A 试样提取液测得的色谱峰面积gA, 峡喃瞠

17、嗣标准工作液测得的色谱峰面积gC, 标准工作液中峡喃瞠酣含量，单位为微克每毫升(g/mU;V 加到试样中的提取液体积，单位为毫升(mL); m 试样质量，单位为克(g); f 提取液的稀释倍数。注:也可用峰高代替峰面积做计算。结果保留至1mg/峙。9.2 峡喃哇嗣质量分数为O.5%20%的样品。预混合饲料或浓缩饲料中峡喃哇酬的质量分数W，p可用式(3)计算2NY/T 727-2003 . ( 2 ) Wtp=41Cs主xf x 10 . . . . . . . (川J-l_ m 式中-W一一试样中峡喃瞠酣的含量，%; A 试样提取液测得的色谱峰面积;人峡喃瞠酣标准工作液测得的色谱峰面积，C,

18、标准工作液中峡喃唾酣含量，单位为微克每毫升(g/mL); V 加到试样中的提取液体积，单位为毫升(mL);m 试样质量，单位为克(g); f 提取液的稀释倍数。注也可用峰高代替峰面积做计算。结果保留至0.01%。10 精密度10. 1 重复性在同实验室由同一操作人员完成的两个平行测定的结果应满足以下要求:a) 当峡喃嗖酣含量为10mg/kg5 000 mg/kg时，相对相差:;:;:8%;b) 当峡喃瞠酣含量为O.5%20%时，相对相差，10% 0 10.2 再现性在不同实验室由不同操作人员用不同的仪器设备完成的两个测定结果应满足以下要求za) 当映喃瞠酣含量为10mg/kg5 000 mg/

19、kg时，相对相差17%;b) 当映喃嗖酣含量为0.5%20%时，相对相差20%。F d NY!T 727-2003 附录A(资料性附录)肤喃晦困标准包谱固和光谱圈20.00 1队。10.00 5.00 0.00 一5.00手2.00 4.00 6.00 8. 00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 留A.1 联暗自鲁吉目标准色潜留367.4 nm 260. 00 280. 00 300. 00 320.。每340. 00 360. 00 380. (阳台400.00 舍20.00 440. 00 图A协2政喃瞧嗣标准光谱阁6 NY

20、/T 727-2003 附录B资料性殉录本标准与ISO14797: 1999(E)技术性和编辑性差异及其原因表B.1 本标准与ISO14797: 1999(E)技术性和编辑性差异及其原因本标准的章条编号技术性及编辑性盖章异原因增加了浓缩饲料的测烧。这一修改是针对我阁浓缩饲料产量较高，以增加方法的适用性.将最低检测限由膝标准的25mg/kg修根据实验数据，我阁饲料!E产中存在主1 改为10mg/kg. 动与被动加入吱喃唾翻的情况，后者古董一般较低，方法力求将两种情况做到有效监控。2 增JJII了GB/1469.1-19览。增j除了GBjT6682. 以适合我国蜀稽。增加了GB/T146991-1吉93.力求本标准与我黯其他将关标准的配s 删除了ISO6498 , 套住g修改了原提取步珊的编排格式。此处简化标准格式，便于撤作者使用。7.3 为编罄性修改.增加了或所测定峡喃喃酣吉量低于8. 1 25 mg/kg。力求做到测定的准确性。将可用改为则必须用四-9 将计算公式中的峰高改为峰面军R.力求与我国其他标准靠近。