GB 4789.34-2012 食品安全国家标准.食品微生物学检验.双歧杆菌的鉴定.pdf

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1、道B中华人民共和国国家标准GB 4789.34-2012 食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定2012-05-17发布2012-07-17实施Q70653， 卢仰。吗耐-3数码防伪中华人民共和国卫生部发布前言本标准代替GB/T4789. 34-2008(食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验。本标准与GB/T4789.34-2008相比，主要变化如下:一一修改了标准的中文名称;一一修改了培养基和试剂;一一删除了果糖-6-磷酸盐磷酸酣酶(F6PPK)测定和双歧杆菌的计数方法。GB 4789.34-2012 I 食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定1 范围本标准规定了食品中双歧杆菌(

2、Bifidobacterium)的鉴定方法。本标准适用于食品中双歧杆菌的鉴定。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下:a) 恒温培养箱:36.C土1.C; b) 气相色谱仪配FID检测器;c) 冰箱:2.C5 .C; d) 天平:感量0.1g; e) 无菌试管:18 mmX 180 mm、15mmX100 mm; GB 4789.34-2012 f) 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器(200Ll000L)及配套吸头zg) 元菌锥形瓶:500mL、250mLo 3 培养基和试剂3. 1 双歧杆菌培养基:见附录A中的A.

3、103.2 PYG液体培养基z见附录A中的A.203.3 甲醇:分析纯。3.4 三氯甲;皖:分析纯。3.5 硫酸z分析纯(体积比)。3.6 冰乙酸:分析纯(体积比)。3. 7 乳酸:分析纯。3.8 乙酸标准溶液:吸取分析纯冰乙酸5.7mL，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1mol/L。3.9 乙酸标准使用液:将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。3. 10 乳酸标准榕液:吸取分析纯乳酸8.4mL，移人100mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1mol/L。3. 11 乳酸标准使用液:将经标定的乳酸标准溶液用水稀

4、释至0.01mol/L。4 鉴定程序双歧杆菌鉴定程序见图1.1 GB 4789.34-2012 5 操作步骤5. 1 样品制备样品25g (mL) +225 mL灭菌生理盐水选择2-3个适当稀释度，各取0.1mL分别加入到双歧杆菌琼脂平板进行涂布反氧，48 h 36 C士1C 挑取菌落接种于双歧杆菌琼脂平板厌氧，48 h 36 C士1C 革兰氏染色，过氧化氢酶试验图1双歧杆菌鉴定程序5. 1. 1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。5. 1. 2 以无菌操作称取25g(mL)样品，置于装有225mL生理盐水的灭菌锥形瓶内，制成1: 10的样品匀液。5.2 稀释及涂布培养步骤5.2. 1

5、用1mL元菌吸管或微量移液器吸取1: 10样品匀液1.0 mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支元菌吸管反复吹打使其混合GB 4789.34-2012 均匀，制成1: 100的样品匀液。5.2.2 另取1mL元菌吸管或微量移液器吸头，按5.2. 1操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用l次1mL灭菌吸管或吸头。5.2.3 根据待鉴定菌种的活菌数，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL稀释液，用L棒在双歧杆菌琼脂平板进行表面涂布，每个稀释度作两个平皿。置36.C士1.C温箱内培养48h :l: 2 h ,

6、培养后选取单个菌落进行纯培养。5.3 纯培养挑取3个或以上的菌落接种于双歧杆菌琼脂平板，厌氧，36.C土1.C培养48h。5.4 镜检及生化鉴定5.4. 1 涂片镜检双歧杆菌菌体为革兰氏染色阳性，不抗酸、元芽抱，元动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。5.4.2 生化鉴定过氧化氢酶试验为阴性。选取纯培养平板上的三个单个菌落，分别进行生化反应检测，不同双歧杆菌菌种主要生化反应见附录B.5.5 有机酸代谢产物测定气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物，见附录C。6 报告根据镜检及生化鉴定的结果(5.的、双歧杆菌的有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比大于1(5.日，报

7、告双歧杆菌属的种名。3 GB 4789.34-2012 A.1 双歧杆菌琼脂培养基A. 1. 1 成分蛋白陈酵母浸膏葡萄糖可溶性淀粉氧化铀西红柿浸出液吐温80肝粉琼脂粉加蒸锢水至A. 1. 2 制法A. 1.2.1 半肮氨酸盐溶液附录A培养基15.0 g 2.0 g 20.0 g 0.5 g 5.0 g 400.0 mL 1. 0 mL 0.3 g 15. 0 g20. 0 g 1 000.0 mL 称取半肮氨酸0.5g，加入1.0 mL盐酸，使半胧氨酸全部溶解，配制成半脱氨酸盐溶液。A. 1. 2. 2 西红柿浸出班将新鲜的西红柿洗净后称重切碎，加等量的蒸馆水在100oC水浴中加热，搅拌90

8、min.然后用纱布过滤，校正pH7.0，将浸出液分装后，121oC高压灭菌15min20 min。A. 1. 2. 3 培养基将A.1.1所有成分加入蒸锢水中，加热溶解，然后加入半肮氨酸盐溶液，校正pH6.8士0.20分装后121oC高压灭菌15min20 min。临用时加热熔化琼脂，冷至500C时使用。A.2 PYG液体培养基A. 2.1 成分4 蛋白陈葡萄糖酵母粉半脱氨酸-HCl盐溶液维生素Kj溶液氧化血红素溶液(5mg/mL) 加蒸馆水至10.0 g 2.5 g 5.0 g 0.25 g 20.0 mL 0.5 mL 2.5 mL 500.0 mL GB 4789.34-2012 A.2

9、.2 制法A. 2. 2.1 盐溶液称取元水氯化钙0.2g，硫酸镜0.2g，磷酸氢二饵1.0 g，磷酸二氢饵1.0 g，碳酸氢纳10.0g，氧化铀2.0g，加蒸馆水至1000 mLo A. 2. 2. 2 氧化血红素溶液(5mg/mL) 称取氯化血红素0.5g溶于1mol/L氢氧化纳1.0 mL中，加蒸馆水至1000 mL, 121 oC高压灭菌15 min20 mino A.2.2.3维生素也溶班称取维生素KI1.0 g，加元水乙醇99mL，过滤除菌，冷藏保存。A. 2. 2. 4 培养基除氯化血红素溶液和维生素Kl溶液外，A.2.1其余成分加人蒸悟水中，加热溶解，校正pH6.0，加入中性红

10、溶液。分装后121oC高压灭菌15mi且20mino临用时加热熔化琼脂，加入氯化血红素溶液和维生素Kl溶液，冷至500C使用。5 GB 4789.34-2012 附录B双歧杆菌菌种主要生化反应双歧杆菌菌种主要生化反应见表B.l。表B.1双岐杆茵茵种主要生化反应编号项目两歧双歧杆菌婴儿双歧杆菌长双歧杆菌青春双歧杆菌动物双歧杆菌短双歧杆菌(B. bifidum) (B. infantis) (B. longum) (B. adolescentis) (B. animalis) (B. breve) 1 甘油2 赤癖醇3 D-阿拉伯糖4 L阿拉伯糖十十+ 5 D核糖+ 十+ + 6 D木糖+ 十d

11、+ + 7 L-木糖8 阿东醇9 -甲基D-木糖试10 D-半乳糖d + 十+ d + 11 D-葡萄糖+ 十+ + 十+ 12 D-果糖d + 十d d + 13 D-甘露糖+ 十14 L山梨糖15 L鼠李糖16 卫矛薛17 肌蹲+ 18 甘露酶19 山梨国事20 -甲基D-甘露糖试21 -甲基D-葡萄糖试+ 22 N-乙酷葡萄糖胶+ 23 苦杏仁试(扁桃武)+ + 24 熊果试25 七叶灵+ 十+ 26 水杨试(柳醇)+ + 十27 D-纤维二糖+ d 28 D-麦芽糖+ + 十+ + 29 D-乳糖+ 十+ + + + 6 GB 4789.34-2012 表B.1(续)编号项目两歧双歧杆

12、菌婴儿双歧杆菌长双歧杆菌青春双歧杆菌动物双歧杆菌短双歧杆菌(B. bidum) (B. in fantis) (B. longum) (B. adolescentis) (B. animalis) (B. breve) 30 D蜜二糖+ 十+ + + 31 D-葳糖十+ + + + 32 D-海藻糖(罩糖33 菊糖(菊根粉)34 D-松三糖十十35 D棉籽糖十十十+ + 36 淀粉十37 肝糖(糖原)一38 木糖E事39 龙胆二糖十十十+ 40 D-松二糖41 D来苏糖42 D-塔格糖43 D-岩糖44 L岩糖45 D阿糖醇46 L阿糖薛47 葡萄糖酸销十一48 2-田基-葡萄糖酸锵49 5国

13、基葡萄糖竣销注:+表示90%以上菌株阳性;一表示90%以上菌株阴性;d表示11%89%以上菌株阳性。7 GB 4789.34-2012 附录C气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物C.1 双歧杆菌培养液制备挑取双歧杆菌琼脂平板上纯培养的双歧杆菌接种于PYG液体培养基，同时用未接种菌的PYG液体培养基做空白对照，厌氧，36.C士1.C培养48h。C.2 标准霞的配制C. 2.1 Z酸标准溶擅准确吸取乙酸5.70mL加水稀释至100.0mL，摇匀，进行标定，配成约1.0 mol/L的乙酸标准溶液。标定方法为:准确称取乙酸3g，加水15mL，酣it指示液2滴，用1mol/mL氢氧化铀溶液滴定，并将滴

14、定结果用空白试验校正。1mL 1 mol/mL氢氧化锅溶液相当于60.05mg的乙酸。C.2.2 Z酸使用擅将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至20.0mmol/L. C. 2. 3 乳酸标准溶液准确吸取含量为85%90%的乳酸0.84mL，加水稀释至100.0mL，摇匀，配成1.0 mol/L的乳酸标准溶液。标定方法为:准确称取乳酸1g，加水50mL，加入1mol/mL氢氧化铀滴定液25mL，煮沸5min，加入酣酥指示液2滴，同时用0.5mol/mL硫酸滴定液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。1 mL 1 mol/mL氢氧化铀溶液相当于90.08mg的乳酸。C. 2. 4 乳酸使用液将乳酸标准溶

15、液用水稀释至20.0mmol/L。C.3 方法C. 3.1 Z酸的处理取双歧杆菌培养液2.0 mL3. 0 mL放入10mL离心管中，加入0.2mL 50%(体积比)硫酸溶液，混匀，加入2.0mL丙圃，混匀后加过量氧化铀，剧烈振摇1min，再加入2.0mL乙膛，振摇1min后，于3 000 r/min离心5min，将上清液转入另一试管中，下层溶液用2.0mL丙酣和2.0mL乙醒重复提取2次，合并有机相，于40.C水浴中用氮气吹至少量溶液存在，用丙酣定容至1.0 mL，混匀后备用。同样操作步骤处理乙酸标准和空白培养液。C.3.2 乳酸的处理取双歧杆菌培养液2.0 mL3. 0 mL放入10mL比

16、色管中，100.C水浴10min，加入0.2mL50%(体积比)硫酸溶液，混匀，加入1.0mL甲晖，于58.C水浴30min后加水1.0 mL，加三氯甲:皖1.0 mL, 振摇3min, 3 000 r/min离心5min，取三氯甲皖层分析。同样操作步骤处理乳酸标准和空白培养液。GB 4789.34-2012 气相色谱条件色谱柱z长2m，内径4mm的玻璃柱，填装涂有20%DNP + 7%吐温60(Tween60)的chromosor bw HP (80 100目);柱温:110 .C;汽化室:150 .C;检测器:150 .C;载气(N2):50 mL/min; 进样量1.0L;外标法峰面积定

17、量。乳酸标准溶液的气相色谱见图C.1，乙酸标准溶液的气相色谱见图C.2.C.3.3 Lh町的.户-Y.由Z酸标准溶液的气相色谱图C.2乳酸标准溶液的气相色谱图C.1.( C.1 ) 结果计算样品培养液中乙酸或乳酸的含量按式(C.l)计算zX=一主主A标XcC.4 样品培养液中乙酸或乳酸的含量，单位为微摩尔每毫升(mol/mL); A样样品培养液中乙酸或乳酸的峰面积;A空空白培养液中乙酸或乳酸的峰面积FA标一一乙酸标准或乳酸标准的峰面积;一一乙酸标准或乳酸标准的浓度，单位为微摩尔每毫升(mol/mL)。式中zx C 允许差C.5 相对相差15%。结果判定C.6 9 如果乙酸(mol/mL)与乳酸

18、(mol/mL)比值大于1，可判定为是双歧杆菌的有机酸代谢产物。NFON-z.gh寸因。国华人民共和国家标准食品安全国家标准中双岐杆菌的鉴定食晶微生物学检验GB 4789. 34-2012 祷中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(10004日网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 开本880X12301/16 印张1字数19千字2012年7月第一版2012年7月第一次印刷* 书号:155066. 1-45329定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB 4789.34-2012 打印日期:2012年7月24HF002