DB13 T 6273-2026 家禽心包积液-肝炎综合征防控技术规程.pdf

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1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 13 河北省地方标准 DB 13/T 62732026 家禽心包积液-肝炎综合征防控技术规程 2026-04-09 发布2026-05-09 实施河北省市场监督管理局发 布 DB 13/T 62732026 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由河北省农业农村厅提出。本文件起草单位：河北农业大学、河北恩康牧业有限公司、尚义县农业农村局。本文件主要起草人：袁万哲、雷白时、韩荞忆、董晓峰、赵款、张武超、张云航、王淼、薛拥志、陈福星、李伟、李睿文、李丽敏、张磊、李小永。DB

2、13/T 62732026 1 家禽心包积液-肝炎综合征防控技术规程 1 范围 本文件规定了家禽心包积液-肝炎综合征的诊断、预防和治疗等内容。本文件适用于家禽心包积液-肝炎综合征的防控。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 GB/T 25886 养鸡场带鸡消毒技术要求 GB/T 32148 家禽健康养殖规范 NY/T 388 畜禽场环境质量标准 NY/T 1168 畜禽粪便

3、无害化处理技术规范 NY/T 3791 鸡心包积液综合征诊断技术 NY/T 5027 无公害食品 畜禽饮用水水质 NY/T 5038 无公害食品 家禽养殖生产管理规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 诊断 流行病学 4.1.1 流行特点 一年四季均可发生，但多发生于秋季、初春或春末、夏初。4.1.2 易感动物 鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑等家禽均可感染，多见于2030日龄的肉鸡。4.1.3 传染源 病禽和带毒家禽。4.1.4 传播途径 主要通过粪便等途径水平感染，也可通过种禽垂直传播。临床症状及病理变化 4.2.1 临床症状 家禽无明显临床表现突然死亡。4.2.2 病理变化 DB

4、13/T 62732026 2 剖检可见心肌柔软、心包积有淡黄色透明的液体，液体遇冷可凝固；肝脏肿胀、质地变脆，个别死亡家禽脾脏肿大、肺脏淤血。发病家禽肝脏中央静脉和窦状隙广泛淤血、肝细胞脂肪变性，局灶性肝细胞坏死，同时细胞浆和细胞核内可见嗜碱性包涵体。病原学诊断 4.3.1 病原分离与鉴定 无菌采集棉拭子、组织等样本，选择鸡胚或LMH等易感细胞，参照NY/T 3791进行病原分离，将收获的尿囊液或者细胞培养液选用4.3.4或者4.3.5所述方法进行核酸鉴定与分析。相关试剂的配制见附录A。4.3.2 病毒中和试验（VN）参照NY/T 3791进行，相关试剂的配制见附录A。4.3.3 间接免疫荧

5、光试验（IFA 方法）按附录B规定的方法执行，相关试剂的配制见附录A。4.3.4 聚合酶链式反应（PCR 方法）参照NY/T 3791进行。也可按附录C规定的方法执行，相关试剂的配制见附录A。4.3.5 实时荧光 PCR 检测方法 参照NY/T 3791进行。也可按附录D规定的方法执行，相关试剂的配制见附录A。5 预防 生物安全管理 养殖场的场址选择、布局和卫生设施应符合NY/T 5038的要求；场区的空气环境质量应符合NY/T 388的规定。严格消毒，其消毒方法和操作步骤应符合GB/T 25886 的要求。定期开展杀虫、防蝇灭鼠工作，消灭传播媒介和传染源。对病死鸡按GB 16548的要求、粪

6、便按NY/T 1168的要求进行无害化处理。饲养管理 饲养管理按照GB/T 32148的规定执行；饮水按照NY/T 5027的规定执行。检疫 引进家禽应隔离观察14天后，采集泄殖腔拭子通过实时荧光PCR检测阴性后混入大群饲养。免疫接种 5.4.1 疫苗 宜采用鸡新城疫、禽流感（H9亚型）、禽腺病毒病（群，4型）三联灭活疫苗，禽腺病毒（I群，4型）灭活疫苗，鸡新城疫、禽流感（H9亚型）、传染性法氏囊病、禽腺病毒病（群，4型）四联灭活疫苗等。5.4.2 预防接种按照疫苗使用说明书执行。6 治疗 隔离消毒 对发病家禽立即隔离，并彻底消毒用具和鸡舍。对病死、剖检家禽尸体应进行无害化处理。DB 13/T

7、 62732026 3 对症治疗 选用干扰素等抗病毒药物与禽腺病毒（群4型）蛋黄抗体，混合肌注，1次/天，连用3 d5 d；饲料或饮水中添加保肝利尿等药物减轻肝脏炎症，排出积液；饲料或饮水中添加黄芪多糖提高机体抵抗力；12次/天，连用3 d5 d。DB 13/T 62732026 4 A A 附录A （资料性）试剂配制 A.1 1.0%琼脂糖凝胶 称取琼脂糖1.0 g，放入100 mL 1TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60时，加入5 L核酸染料，均匀铺板，厚度为3 mm5 mm。A.2 50TAE 电泳缓冲液 A.2.1 0.5 mol/L EDTA溶液（pH 8.0）称取EDTA 1

8、8.61 g，加灭菌双蒸水至100 mL，后用氢氧化钠调pH至8.0。A.2.2 TAE电泳缓冲液（50）Tris 242 g，冰乙酸57.1 mL，0.5 mol/L EDTA 100 mL，加灭菌双蒸水至1000 mL。A.3 溴化乙锭（EB）溶液 溴化乙锭20 mg，加灭菌双蒸水至20 mL。A.4 DEPC 水 焦碳酸二乙酯（DEPC）50 L，加灭菌双蒸水至100 mL，室温放置6 h8 h，121高压灭菌20 min，分装到1.5 mL DEPC处理过的离心管。A.5 PBS 缓冲液 A.5.1 A液（0.2 mol/L磷酸二氢钠水溶液）NaH2PO4H2O 27.6 g先用适量蒸

9、馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000 mL。A.5.2 B液（0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液）Na2HPO47H2O 53.6 g，（或Na2HPO412H2O 71.6 g或Na2HPO42H2O 35.6 g）先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000 mL。A.5.3 0.01 mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液的配制 A液14 mL，B液36 mL，加氯化钠（NaCl）8.5 g，最后用蒸馏水稀释至1000 mL。A.6 细胞培养用溶液 A.6.1 2104 U/mL青霉素链霉素液（双抗）青霉素、链霉素各2106 U溶于100 mL三蒸水中，过滤除菌，分装后，-20冻存备用

10、A.6.2 500 mmol/L Hepes贮存液 1.2 g Hepes溶于10 mL三蒸水中，经121高压灭菌15 min，置-20冻存备用。A.6.3 7.5%NaHCO3 7.5 g NaHCO3溶于100 mL三蒸水中，115高压灭菌20 min，4保存备用。A.6.4 5DMEM浓缩液 DB 13/T 62732026 5 将DMEM粉剂按厂家说明书配制，过滤除菌，4保存，使用时进行5倍稀释。A.6.5 含10胎牛血清 DMEM培养基（生长液）于264 mL三蒸水中加入80 mL 5DMEM溶液，40 mL FBS（胎牛血清），2 mL 2104 U/mL青链霉素液，4 mL 5

11、00 mmol/L Hepes贮存液，用7.5%NaHCO3溶液调节pH值至7.27.4左右，4保存备用。A.6.6 含2胎牛血清DMEM培养基（维持液）于296 mL三蒸水中加入80 mL 5DMEM溶液，8 mL FBS，2 mL 2104 U/mL青链霉素液，4 mL 500 mmol/L Hepes贮存液，用7.5%NaHCO3溶液调节pH值至7.27.4左右，4保存备用。A.6.7 10Na2EDTA-胰酶溶液（2.5%）Na2EDTA 0.2 g，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO412H2O 2.89 g，KH2PO4 0.2 g，溶于90 mL三蒸水中，再加

12、入2.5 g胰酶（1：250），完全溶解后，加三蒸水补足至100 mL，NaHCO3调节pH至7.27.4，过滤除菌，分装，-20保存备用，使用时1：10稀释。DB 13/T 62732026 6 B B 附录B （资料性）间接免疫荧光试验 B.1 材料 LMH细胞、生长液、维持液、0.25%胰酶溶液、禽腺病毒4型鼠源单克隆抗体或兔源多克隆抗体、荧光标记兔抗鼠IgG或荧光标记山羊抗兔IgG、丙酮。B.2 仪器设备 倒置荧光显微镜、CO2培养箱 B.3 操作步骤 B.3.1 复苏LMH细胞，于37 CO2培养箱中培养，待细胞长成良好的细胞单层后，用0.25%胰酶溶液进行消化。B.3.2 将LMH

13、细胞消化后，以约106个/mL的细胞密度转入96孔细胞培养板，于37 CO2培养箱中培养，待细胞长成良好的细胞单层后，接种待检病毒，同时设立阴阳性对照，于37吸附1 h后，加入100 L维持液继续培养。B.3.3 接毒一定时间后，倒去上层液体，用-20预冷的丙酮室温固定15 min，自然干燥。B.3.4 滴加一定浓度单克隆抗体或多克隆抗体，37湿盒作用45 min；PBS漂洗3次，每次5 min；滴加1:40稀释的含0.01伊文斯兰的荧光标记（FITC）兔抗鼠IgG或山羊抗兔IgG，37湿盒作用45 min；PBS漂洗3次，每次5 min；吸干液体后立即于荧光显微镜下观察。B.4 结果判定 阳

14、性对照进行IFA后细胞浆中可见特异性绿色荧光，阴性对照进行IFA后细胞浆中未见特异性绿色荧光，阴阳性同时成立表明试验有效，否则试验无效。阴阳性同时成立的情况下，若待检样品进行IFA后细胞浆中可见特异性绿色荧光，则判定为待检样品禽腺病毒4型阳性。DB 13/T 62732026 7 C C 附录C （资料性）聚合酶链式反应 C.1 材料 引物信息见表C.1。表 C.1 引物信息 引物/探针名称 引物/探针浓度 序列（5-3）FAdV4-F（上游引物）10 mol/L TTACGCTTACGGTGCCTACGT FAdV4-R（下游引物）10 mol/L CCGCGTTATTCATGATCCAGT

15、A FAdV4-P（探针）10 mol/L FAM-CGACGGTTCCCAGTCCCTCACG-Eclipse C.2 仪器设备PCR仪、凝胶成像系统、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、微量可调移液器（10 L、100 L、1000 L）、水浴锅。C.3 样品的采集与处理 C.3.1 样品的采集 C.3.1.1 棉拭子采集 将棉拭子深入泄殖腔转三圈；将采集后的棉拭子放入盛有1.0 mL PBS（配制方法见附录A中A.5）的1.5 mL的离心管，加盖，编号。C.3.1.2 组织采集 剖检家禽，用剪刀采集心肝脾肺肾法氏囊等组织，装入一次性灭菌容器，编号。C.3.2 样品的处理 C.3.2

16、1 棉拭子处理方法 将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，4条件下3000 r/min离心15 min，取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中，编号备用。C.3.2.2 组织的处理方法 将所采集的组织置于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比（1:5）加入样品保存液进行充分研磨，4条件下3000 r/min离心15 min。取上清转入无菌的1.5 mL的离心管备用，编号。C.4 操作步骤 C.4.1 阴阳性对照 以灭活的禽腺病毒4型细胞培养物或者感染鸡组织作为阳性对照，以正常细胞或者是正常鸡组织作为阴性对照。对照均应在-20保存。同时进行阴

17、阳对照样品的核酸提取。C.4.2 核酸提取 DB 13/T 62732026 8 采用商品化核酸提取试剂，按照说明书进行操作。C.4.3 PCR反应 反应管中依次加入无核酸酶水6 L、2Taq MasterMix 10 L、所提取的DNA溶液1 L、10 mol/L的上游引物各0.5 L，反应体系共计20 L。经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。PCR扩增条件：94预变性3 min，94变性10 s，56退火30 s，72延伸57 s，循环30次；72延伸5 min。扩增反应结束后立即进行电泳或置于4条件下备用。C.4.4 扩增产物电泳检测 制备1.0%琼脂糖凝胶板。在电泳槽内加入1TA

18、E电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取3 L5 L扩增产物加到凝胶孔，加入DNA分子量标准（100 bp）。恒压（110V）电泳30 min40 min，在凝胶成像系统上观察结果。C.5 结果判定 阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性的条带；阴性的扩增产物没有预期的目的条带；阴阳性同时成立表明试验有效，否则试验无效。在试验结果成立的前提下，如果样品的PCR产物电泳后在954 bp位置出现特异性的条带，则判定为禽腺病毒4型核酸检测阳性；如果样品的PCR产物电泳后在954 bp位置未出现特异性的条带，则判定为禽腺病毒4型核酸检测阴性。DB 13/T 62732026 9 D

19、 D 附录D （资料性）实时荧光 PCR 检测方法 D.1 材料 引物与探针信息见表D.1。引物/探针名称 引物/探针浓度 序列（5-3）FAdV4-F（上游引物）10 mol/L TTACGCTTACGGTGCCTACGT FAdV4-R（下游引物）10 mol/L CCGCGTTATTCATGATCCAGTA FAdV4-P（探针）10 mol/L FAM-CGACGGTTCCCAGTCCCTCACG-Eclipse D.2 仪器设备 实时荧光PCR仪、台式低温高速离心机、冰箱、微量可调移液器（10 L、100 L、1000 L）。D.3 样品的采集与处理 D.3.1 样品的采集 D.3.

20、1.1 棉拭子采集 将棉拭子深入泄殖腔转三圈；将采集后的棉拭子放入盛有1.0 mL PBS（配制方法见附录A中A.5）的1.5 mL的离心管，加盖，编号。D.3.1.2 组织采集 剖检家禽，用剪刀采集心肝脾肺肾法氏囊等组织，装入一次性灭菌容器，编号。D.3.2 样品的处理 D.3.2.1 棉拭子处理方法 将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，4条件下3000 r/min离心15 min，取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中，编号备用。D.3.2.2 组织的处理方法 将所采集的组织置于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比（1:5）加入样品保

21、存液进行充分研磨，4条件下3000 r/min离心15 min。取上清转入无菌的1.5 mL的离心管备用，编号。D.4 操作步骤 D.4.1 阴阳性对照 以灭活的禽腺病毒4型细胞培养物或者感染鸡组织作为阳性对照，以正常细胞或者是正常鸡组织作为阴性对照。对照均应在-20保存。同时进行阴阳对照样品的核酸提取。D.4.2 核酸提取 采用商品化核酸提取试剂，按照说明书进行操作。DB 13/T 62732026 10 D.4.3 实时荧光PCR反应 在反应管中依次加入7 L无核酸酶水、12.5 L Premix Ex Taq、3 L上述DNA溶液、0.5 L 10 mol/L探针、1 L 10 mol/

22、L的上游引物、1 L 10 mol/L的下游引物，最终至总体积为25 L。经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。实时荧光PCR扩增条件：95预变性30 sec，94变性10 sec，60退火/延伸35 sec，循环40次。在60退火延伸阶段收集荧光信号。D.5 结果判定 点击分析界面，取3-15个循环的荧光信号确定基线（baseline）。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品及阴性样本的扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，不出现Ct值并且与阳性对照的指数期相交为准。阴性对照应没有Ct值显示或显示Ct值为40；阳性对照的Ct值应小于30.0。否则实验视为无效。检测样本Ct值小于等于30.0，且曲线有明显的指数增长期，判定为禽腺病毒4型核酸阳性；检测样本Ct值大于30.0且小于40时，重复一次，如果Ct值仍小于40，且曲线有明显的指数增长期，判定为禽腺病毒4型核酸阳性，否则为阴性。Ct值大于等于40，判定为禽腺病毒4型核酸阴性。