DB43 T 2472-2022 猪冷冻精液.pdf

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1、 ICS 65.020.30 CCS B43 43 湖南省地方标准 DB 43/T 24722022 猪冷冻精液 Boar frozen semen 2022-12-09 发布 2023-03-09 实施湖南省市场监督管理局发 布 DB 43/T 24722022 I 目次 前言.III 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 质量要求.1 5 抽样.2 6 检验方法.3 7 检验规则.3 8 标志、标签及随行文件.4 9 包装、运输和贮存.4 附录 A（规范性）精子顶体完整率检验.6 DB 43/T 24722022 III 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准

2、化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：湖南省光大牧业科技有限公司、湖南省畜牧兽医研究所、宁乡市畜牧水产事务中心、泸溪县畜牧水产事务中心、长沙县农业农村局、湘阴县畜牧水产服务中心、长沙市农业农村局。本文件主要起草人：刘海林、张佰忠、段洪峰、朱建军、朱立军、张翠永、刘东翔、樊志坚、蒋桂韬、陈晨、刘莹莹、陈方志、姜虹、文元芳、郑引妹、吴发平、陈新娟、粟玉刚、薛爽。DB 43/T 24722022 1 猪冷冻精液 1 范围

3、 本文件规定了猪冷冻精液的质量要求，抽样，检验方法和规则，标志、标签及随行文件，包装、运输和贮存。本文件适用于种猪细管冷冻精液的生产、检验、运输、贮存。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 GB/T 5458 液氮生物容器 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T 14174 大口径液氮容器 GB/T 16551 猪瘟诊断技术 GB/T

4、18646 动物布鲁氏菌病诊断技术 GB/T 18648 非洲猪瘟诊断技术 GB/T 18935 口蹄疫诊断技术 GB 23238-2021 种猪常温精液 SN/T 1919 猪细小病毒病检疫技术规范 SN/T 2708 猪圆环病毒病检疫技术规范 农业部高致病性猪蓝耳病防治技术标准 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。冷冻精液 frozen semen 经特殊方法处理，超低温冷冻后可在液氮中（-196）长期保存的种猪精液。4 质量要求 种猪 应选择体型外貌和繁殖性能等符合种用要求、三代系谱资料齐全、体质健康的公猪。冷冻精液 4.2.1 冷冻精液细管外观应无裂痕，两端封口严密，所印字迹清

5、晰易认、信息齐全。DB 43/T 24722022 2 4.2.2 解冻后的精液应符合表 1 的规定。表1 冷冻精液解冻后技术要求 项目 技术要求 剂型/mL 0.5 1 剂量/mL 0.4 0.8 精子活力/%60 前向运动精子数/（108个/剂）0.6 1.0 精子畸形率/%20 精子顶体完整率/%60 细菌数/(cfu/剂)500 1000 病原 非洲猪瘟病毒、口蹄疫、猪瘟病毒、猪圆环病毒型、高致病性猪蓝耳病毒、猪细小病毒和猪布鲁氏菌病原学检测呈阴性 5 抽样 抽样条件 5.1.1 抽样场所应洁净、干燥和避光，抽样用具和样品容器应清洁，样品容器应具有保温和贮存性能。5.1.2 抽样过程中

6、，样品不应因抽样受到污染，应防止样品原有品质的变化。5.1.3 当从外观可明显看出原始样品与同批样品品质不一致或冷冻精液棉塞端异常时，应立即停止抽样。5.1.4 抽样人员应对抽样、液氮生物容器使用以及液氮特性非常熟悉。5.1.5 抽样的每头公猪样品应为同一生产批次的产品，抽样数量不得少于 16 支（含复检备样）。抽样方法 5.2.1 抽样器具 抽样前应准备下列器具：a)抽样器（长镊子等）；b)液氮生物容器；c)广口保温容器；d)样品袋（其容量足够容纳所需抽的原始样品）。5.2.2 操作步骤 5.2.2.1 按随机抽样方法，对确定抽样的种猪，随机从冷冻精液贮藏容器中抽取一个样品袋，迅速浸泡入盛有

7、液氮的广口保温容器中。5.2.2.2 用抽样器在液氮中打开样品袋，从中抽出样品装入贮精管中再转移入样品袋，然后将样品袋口扎紧。5.2.2.3 每个样品袋应栓系标签，详细注明抽样地点和日期、生产或销售单位名称、猪号、样品数、抽样人姓名以及其他需要说明的重要事项。DB 43/T 24722022 3 5.2.2.4 存放抽样冷冻的低温容器质量应符合 GB/T 5458 规定，使用前经过清洗后加入新鲜液氮。从广口保温容器中转移入液氮生物容器中，期间暴露在空气中的时间不应超过 5 s，样品应保存于液氮中，标签栓系在液氮生物容器的把手上，盖上盖子并注意严实。样品由专人保管，抽样登记单与样品随行。样品包装

8、、标记应保持原样。6 检验方法 解冻与点样 取1支细管冷冻精液置于50 恒温水浴中解冻15 s，与稀释液混合后，抽精液约10 L置于预热到38 的载玻片上加盖玻片，用精子质量分析系统（CASA）检测分析，也可用200X显微镜观察活力，每样片观察3个视野，并应观察不同液层内的精子运动状态，进行全面评定。检验有效时限为解冻后2 min10 min。测定 6.2.1 外观 采用目测法进行。6.2.2 剂量、精子活力、前向运动精子数和精子畸形率 按GB 23238-2021附录A中规定的方法进行。6.2.3 顶体完整率 按附录A规定执行。6.2.4 细菌数 按GB 4789.2规定执行。6.2.5 病

9、原 病原的检验方法见表2。表2 病原检验方法 病原 检验方法 非洲猪瘟 GB/T 18648 口蹄疫 GB/T 18935 猪瘟 GB/T 16551 高致病性猪蓝耳病 农业部高致病性猪蓝耳病防治技术标准 猪圆环病毒病 SN/T 2708 猪细小病毒病 SN/T 1919 布鲁氏菌病 GB/T 18646 7 检验规则 常规检验 DB 43/T 24722022 4 常规检验项目为外观和精子活力，生产批入库前和销售前应进行常规检验。型式检验 7.2.1 型式检验项目为全部质量要求。7.2.2 在正常生产情况下，每季度至少进行 1 次。7.2.3 有下列情况之一时，应进行型式检验：a)产品定型投

10、产时；b)生产工艺、配方或主要原料来源有较大改变，可能影响产品质量时；c)停产 3 个月以上，重新恢复生产时；d)常规检验结果与上次型式检验结果有较大差异时；e)行政管理部门提出检验要求时。判定 7.3.1 所验项目全部合格，判定为该批次产品合格。7.3.2 有任何指标不符合表 1 规定时，可自同批产品中重新加倍取样进行复检。若复检结果仍不符合要求，则判定该批产品不合格。7.3.3 各项目指标的极限数值判定按 GB/T 8170 中修约值比较法执行。8 标志、标签及随行文件 标志 8.1.1 冷冻精液细管外壁应清楚标明生产站名、种猪品种代码、个体号、生产日期或批次。8.1.2 种猪品种代码以畜

11、禽遗传资源鉴定及审定部门公布的为准。标签 8.2.1 在硬纸板或无纺布上标注种猪品种代码、个体号、细管数量、包装日期、产品标准编号、生产许可证号、生产者名称和地址及联系方式、贮存方式和条件、使用说明等。8.2.2 标签信息可包括生产单位商标或徽标，以及可追溯的其他信息，有条件的单位宜使用二维码信息，但二维码信息中至少应包括 8.2.1 中的信息。随行文件 随行文件应包括种猪系谱、检疫证明、冷冻精液检验合格证明、生产经营许可证等。9 包装、运输和贮存 包装 9.1.1 包装冻精细管应在液氮或-140 以下的环境中进行。9.1.2 将冻精细管分批次装入贮精管，包装后的细管冷冻精液其棉塞端应朝向贮精

12、管的底部，不应倒DB 43/T 24722022 5 置。9.1.3 用灭菌纱布袋将装有冷冻精液的贮精管包装起来，每头公猪每批次使用一个灭菌纱布袋，每袋冻精细管不应超过 100 剂。运输 9.2.1 应在贮存容器的明显位置呈现“向上”“小心轻放”等符号图示标志。9.2.2 运输过程中贮存容器不应碰撞或剧烈震动。贮存 9.3.1 冷冻精液应贮存于装有液氮的容器，容器质量应同时符合 GB/5458 和 GB/T 14174 的规定。9.3.2 冷冻精液由一个容器转移至另一容器时，暴露在空气中的时间不应超过 5 s。9.3.3 应有专人负责添加液氮，并检验液氮容器的状况，如发现异常，应立即将冻精转移

13、至安全液氮容器。9.3.4 贮存冻精场所的环境条件应阴凉、干燥、清洁和通风良好。DB 43/T 24722022 6 A A 附录A （规范性）精子顶体完整率检验 A.1 设备和材料 A.1.1 荧光显微镜。A.1.2 移液器。A.1.3 离心机。A.1.4 冰箱。A.1.5 3%PVP液。A.1.6 PBS。A.1.7 载玻片。A.1.8 FITC-PNA液（FITC-PNA溶于PBS液中，100 g/mL）。A.1.9 固定液（90%甘油，甘油:PBS液9:1）。A.2 检验方法 A.2.1 可使用检测精子活力的待检样品，取0.5 mL加到 4 mL 3%PVP液面上，离心（800 g，3

14、 min，室温）、弃上清，重复1次。A.2.2 用PBS（37）重悬调整密度至每毫升（12）106个精子，取 20 L涂片，空气干燥。A.2.3 滴加10 L20 L FITC-PNA液，将玻片倾斜使染液均匀分布，置于4 黑暗潮湿环境静置20 min。将玻片插入PBS液中浸洗2次，移至室温条件黑暗环境空气干燥30 min。A.2.4 滴 10 L固定液，加盖玻片，无色指甲油封片，400荧光显微镜下观察并计数，每个抹片观察200个以上的精子（分左、右2个区），取2抹片的平均值。A.2.5 在激发波长480 nm、发射波长530 nm紫外光激发下可区分出4种不同类型的精子：a)顶体完整精子，顶体顶部发强光且边缘规则光滑；b)顶体部分破坏精子，顶体前区杂乱发光且边缘不规则；c)顶体前帽缺失的精子，仅在赤道区有荧光；d)顶体完全破坏精子，无荧光。A.3 计算 精子顶体完整率按式A.1计算：=（1/）100 (A.1)式中：精子顶体完整率，%；DB 43/T 24722022 7 1顶体完整精子数，单位为个；精子总数，单位为个。两者差异为（A1-A2）的绝对值，此值应小于Q值对应的可接受差异值(基于95%可信区间的标准误)。如果差异值是可接受的，报告畸形率的平均值(即该精液样品的畸形率)；如果差异值太大，摒弃结果并重复制片重新评估。