DB15 T 2554—2022 发酵番茄渣中益生性乳酸菌的分离与鉴定技术规程.pdf

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1、 ICS 67.080.01 CCS X10 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 2554 2022 发酵番茄 渣中 益生 性乳酸菌 的分离与 鉴定技术规程 Technical regulation for the isolation and identification of probiotic lactic acid bacteria derived from fermented tomato pomace 2022-04-25 发布 2022-05-25 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 2554 2022 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2

2、020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 由内 蒙古 自治 区畜 牧业标 准化 技术 委员 会（SAM/TC 19）归口。本文件 起草 单位：内 蒙古 自治区 农牧 业科 学院、内 蒙古大 学。本文件 主要 起草 人：杜 瑞 平、王潇、特 日格 勒、张兴 夫、武晶 晶、宋利 文、云伏 雨、张春 华、羿静、康长清。DB15/T 2554 2022 1 发酵番茄 渣中益 生性乳酸 菌的分 离与鉴定 技术规 程 1 范围 本文件 规定 了发 酵番 茄渣 中益生 性乳 酸菌 分离 与鉴 定的规 范性 引用 文件、术 语与定 义、材料 及操

3、作规程等 技术 要求 与规 范。本文件 适用 于发 酵番 茄渣 中益生 性乳 酸菌 的分 离与 鉴定。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 4789.35 食 品安 全国 家标准 食 品微 生物 学检 验 乳酸 菌检 验 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。益生性 乳酸 菌 lactic acid bacteria(LAB）能利用 可

4、发 酵碳 水化 合物 产生大 量乳 酸、无芽 孢且 具有益 生性 能的 革兰 氏染 色阳性 细菌 的总 称。发酵番 茄渣 tomato pomace 生产番 茄酱(汁)后 的番茄 渣（主 要由 果 皮、种子和 少量的 残余果 肉 组 成）经 微生物 发酵后 的产 物。序列比 对 sequence alignment 为确定 两个 或多 个序 列之 间的相 似性 或同 源性，而 将它们 按照 一定 的规 律排 列，检 测序 列之 间的 相似性，从而 发现 生物 序列 中的功 能、结构 和进 化 信 息的一 种生 物信 息学 方法。进化树 evolutionary trees 通 过 系 统发 育

5、 分析 所 推断出 来 的 进化 关 系一 般 用分枝 图 表 即进 化 树来 描 述，这 个 进 化树 就 描述 了同一谱 系的 进化 关系，包 括了分 子进 化、物种 进化 以及分 子进 化和 物种 进化 的综合。4 材料 DB15/T 2554 2022 2 番茄渣 来源 来自工 厂的 新鲜 番茄 渣。发酵番 茄渣 的制 备与 保存 每个聚 乙烯 塑料 袋中 称取100 g 番 茄渣，用 真空 包装 机抽成 真空 并封 口。每个 处理设3个 重复，于户外进行 为期30 d、60 d 和90 d 的厌 氧发 酵，在第30 d、60 d 和90 d 分别 取样，将样品 装在 无菌 袋中，放入

6、冰 盒带 回实 验室 尽快 进行乳 酸菌 的分 离。5 操作规 程 菌株和 细胞 5.1.1 菌株 指示菌：致 病性 的大 肠杆 菌（Escherichia coli ATCC25922），金黄 色葡 萄球 菌（Staphylococcus aureus ATCC25923），购 自 中国普 通微 生物 菌种 保藏 管理中 心。试验菌：从 发酵 番茄 渣中 分离出 的乳 酸菌。5.1.2 细胞 Caco-2 细胞，购 自中 国科 学院典 型培 养物 保藏 委员 会细胞 库。仪器设 备 电子天 平（感量0.01 g），超纯 水系 统，高压 蒸汽 灭菌锅（137，0.25 MPa），超低 温冰 箱

7、（-50-86），恒温 摇 床，恒 温培 养箱，厌 氧培 养箱，普通 离心 机，紫外 分光光 度计，涡 旋振 荡仪，倒置荧 光显 微镜（40 x640 x），pH 计，PCR 仪，电 泳仪，凝胶 成像 仪，低温 高速离 心机（20000 g，8 10）。试剂与 耗材 5.3.1 试剂 MRS琼脂 培养 基，MRS 肉汤，MEM 培 养液，脑心 浸出 液 培养基，细菌 基因 组DNA 提 取试剂 盒，Agarose Gel DNA Extraction Kit，EcoT14 digest DNA Marker，DL2000 DNA Marker，Taq DNA 聚 合酶，琼 脂糖，胎 牛血清，青

8、 链霉素 双抗，PBS 缓 冲液，胃蛋 白 酶，胰 蛋白酶，胆盐，甘 油、过 氧化氢、氯 化钠、浓盐酸、巯 基乙 酸钠、丙 酮酸钠、碳 酸氢 钠、氢氧 化钠、甲醇 等均 为分 析纯。5.3.2 耗材 T25细 胞培 养瓶，6孔 细胞 培养板，90 mm 培 养皿，15 mL/50 mL 离 心管，500 mL/250 mL 锥形 瓶，0.22 M滤 膜，牛津 杯，加样 器，棉拭 子等。5.3.3 溶液配 制 见附录A。乳酸菌 的分 离、纯化 和保 藏 5.4.1 乳酸菌 的分 离 DB15/T 2554 2022 3 称取10.0 g 发酵 番茄 渣加 入放有90 mL 无菌 生理 盐水 的锥

9、形 瓶中，置 于恒 温摇 床中震 荡30 min 制备菌悬液 并进 行十 倍梯 度稀 释，稀释 液涂 布于MRS 平板 上，37 厌氧 条件 下培 养48 h。根 据菌 落的 大小、颜色、形状 及边 缘特 征将 不同的 菌在MRS 平板 上进 行 分离。5.4.2 纯化与 保藏 将已经 分离 的菌 株在 MRS 平板上 反复 划线 纯化。将 纯化的 单菌 落接 种于MRS 肉 汤中，37 厌氧 条件下培 养24 h，将 菌液 与60%的 无菌 甘油 以7：3的 比 例混匀，密 封后 放置 在涡 旋震荡 仪上 震荡 混匀，-80 保存。乳酸菌 鉴定 5.5.1 形态学 鉴定 按GB 4789.3

10、5 的 规定 操作。5.5.2 分子学 鉴定 5.5.2.1 DNA 提取 取出-80 冻 存的 乳酸 菌 菌株，室温 融化 后用 接种 环挑取 适量 菌液，采 用三 区划线 法在MRS 平板 上划线进 行活 化。用接 种环 挑取单 菌落 到MRS 肉 汤中 进 行扩大 培养，37 厌氧 培 养18 h用于DNA 的提 取，方法参 照细 菌基 因组DNA 提 取试剂 盒说 明书。5.5.2.2 扩增 提取出 的DNA 用于 16S rDNA 序 列的 扩增。扩 增引 物 为细 菌16S rDNA 基 因序 列通用 引物，上 游引物：27F 5-GAGTTTGAT CCTGGCTCA-3；下 游

11、引 物：1492R 5-TACCTTGTTACGACTT-3。PCR 反 应体 系如 下（50 L）：Template DNA，2 L；dNTP mixture，4 L；Taq(5 U L-1)，0.25 L；10 PCR buffer(Mg2+-free)，5 L；MgCl2(25 mol L-1)，3 L；27F(10 mol L-1)，1 L；1492R(10 mol L-1)，1 L；ddH2O，33.75 L。PCR 反 应条 件：94 预变性5 min；94 变 性1 min，53 退火1 min，72 延伸2 min，共30 个循环；72 10 min。5.5.2.3 测序 PC

12、R 扩 增产 物电 泳后，凝 胶 成像仪 下观 察，可 以看 到1500 bp 左右 的条 带。PCR 产 物回收 参照Agarose Gel DNA Extraction Kit 说明书，回 收产 物送 商业 公司测 序。5.5.2.4 序列比 对 利用Blast(http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将 待 测 菌 株 的16S rDNA 序列与Genbank 中已 知细菌16S rDNA 序 列进 行比对。将测 序结果与 标准 菌株的 序列 导入到ClustalX1.83中进行校准 对齐，通 过MEGA5.05 将待 测菌 与标 准菌 的序 列 进

13、行对 比，计算 出进 化距 离并用neighbor-joining 法建树，Bacillus subtilis NCDO 1769 作 为外 群，采用Bootstrap 法，重复 次 数为1000。益生性 乳酸 菌的 筛选 5.6.1 耐酸性 测定 将冻存 乳酸 菌活 化后 接种 于MRS 肉汤 中。取5 mL菌液，1000 g 离心10 min，弃 上清。加入5 mL 无菌生理盐 水混 匀制 成菌 悬液。分别 取1 mL 菌悬 液与9 mL 人工 胃液 混匀，37 培 养，在0 h、3 h 取 样，梯DB15/T 2554 2022 4 度稀释 涂板 计数 计算 存活 率，每种 菌3 个重

14、复。存活 率=3 h 的菌 落数/0 h 的菌 落数100%，存 活率 大 于10%即 认定 为可 以耐 受胃 酸的环 境。5.6.2 胆盐耐 受性 测定 将冻存 乳酸 菌活 化后 挑单 菌落接 种于MRS 肉汤 中。将 菌液按5%的 接种 量接 种于 含0.0%、0.3%、0.5%和1.0%胆 盐的MRS-THIO 培 养基中。37 厌氧 培养24 h，分 别测 定不 同胆 盐浓 度培养 基的OD值 来计 算菌株对胆 盐的 耐受 性。胆盐 的 耐受性=含 有不 同浓 度胆 盐 的培养 基的OD值/不 含胆 盐 培养基 的OD 值100%，存活率 大于10%即认 定为 具有胆 盐耐 受性。5.

15、6.3 乳酸菌 对Caco-2 细 胞粘 附 能力的 测定 5.6.3.1 Caco-2 细 胞培 养 5.6.3.1.1 复苏培 养 从液氮 中取 出Caco-2 细胞 冻存管，立 即放 入40 的 水浴中 摇晃 融化。将 细胞 悬液吸 入装 有8 mL 培养液的 离心 管中，300 g离心8 min，弃 上清 后加 入12 mL的新 鲜培 养液，用 移液 枪吹打 均匀 后加 到培 养瓶中，于37、5%CO2 培养箱 中培 养。5.6.3.1.2 传代消 化 待细胞 长到80%90%的 时候进 行传代。吸 掉旧的 培养液，用加 了双 抗的PBS 洗两次，然后 加入1 mL 2 mL的 胰酶，

16、于37 放置2 min。显微 镜观 察，大部分 细胞 变为 圆形 后加 血清终 止消 化，反 复吹 打直到细 胞完 全脱 落。300 g 离心8 min，弃 上清 后将 细 胞分装 到培 养瓶 中培 养。培养好 后消 化制 成细 胞悬液，加到 放有 盖玻 片的6 孔 板中(2 mL/well)，待细 胞 贴壁后，吸掉 旧的 培养 液，用 不加 双抗 的PBS 洗2 次后用于 粘附 实验。5.6.3.2 粘附能 力的 测定 将冻存 的乳 酸菌 活化，挑 取单菌 落接 入MRS 肉 汤中 厌氧培 养 24 h。1000 g 离心 10 min，用 无菌 的PBS 洗3 次 后，用MEM 培 养液悬

17、 浮 至 1.0 108 CFU/mL，用 于后 续的 粘附 实验。分别取1 mL 的菌 液加 入5.6.3.1.2 所述6孔 板中37 培养3 h 后 终止，用 无菌PBS 洗5 次，洗掉 未粘 附的乳酸 菌，室 温晾 干后 加 甲醇固 定30 min，将盖 玻 片进行 革兰 氏染 色，油 镜 下观察。每张 盖玻 片随 机 计数50个 细胞 上粘 附的 乳酸 菌数量，每 组3 个平 行。每 个 细胞上 粘附3个 以上 乳酸 菌 即认定 为具 有粘 附能 力。5.6.4 抑菌能 力的 检测 5.6.4.1 菌株活 化培 养 5.6.4.1.1 乳酸菌 活化 培养 将冻存 乳酸 菌活 化后 挑取

18、 单菌落 接种 于MRS 肉 汤中。37 厌氧 培养24 h 后，1000 g离心10 min 后取上清。5.6.4.1.2 致病菌 活化 培养 将冻存 于-80 的Escherichia coli 和Staphylococcus aureus 分 别在 固体LB 培 养基和 脑心 浸出 液培养基 上划 线。37 过 夜 后，挑 取单 菌落 分别 接种 于相应 的液 体培 养基 中，37 培 养24 h 后 备用。5.6.4.2 抑菌能 力检 测 DB15/T 2554 2022 5 分别取100 L Escherichia coli 和Staphylococcus aureus 菌 液涂 布

19、于 固体LB培养基 和脑 心浸 出液培养 基上，然后 将牛 津 杯放于 平板 中央，每种 乳 酸菌做3个 平行 实验。在牛 津杯的 中央 加100 L乳酸菌液，37 培 养24 h 后 测 定每种 菌抑 菌圈 的直 径（mm），结果 用平 均差 标 准 差表示。对 大肠 杆菌 的抑 菌 圈 直径 大 于等 于5.40 0.20 即可 认 定为 具有 抑菌 能 力，对 金 黄色 葡 萄球菌 的 抑 菌圈 直 径大 于 等于15.50 0.10 即 可认 定为 具 有抑菌 能力。DB15/T 2554 2022 6 A A 附录A（规范 性）溶液配 制 表A.1 规定 了溶 液配 制方 法。表A.

20、1 溶液 配制 溶液名称 成分 制备 人工胃液 氯化钠 2 g 胃蛋白酶 3.5 g 超纯水 1000 mL 1N 盐酸调pH 至 3.0，过滤除 菌，4 保存。MRS-THIO 培养基 100mL MRS 培养基 0.2 g 巯基乙酸钠 121 高压灭菌15 min。LB 培养基 酵母提取物 5 g 胰蛋白胨 10 g 氯化钠 10 g 超纯水 1000 mL 氢氧化钠调 pH 至 7.0 7.4，121 高压灭 菌 15 min。Caco-2 细胞培养液 MEM 培养液 156 mL 丙酮酸钠 2 mL 青链霉素双抗 2 mL 碳酸氢钠 0.3 g 胎牛血清 40 mL 过滤除菌，4 保存。