DB45 T 2446-2022 反季节秀珍菇菌种制备技术规程.pdf

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1、 ICS 65 . CCS B 3 广 Te c 2022 - 02 0. 99 3 9 西 壮 反 季 c hnical - 01 - 26 发 壮族 季 节 秀 code of 发 布 广西 壮 族 自 秀 珍 菇 practic e pul m 壮 族自治 区 自 治 菇 菌 种 e for pr m onarius 区 市场监 督 区 种 制 备 ocess o f cultur e 督 管理局 地 D B 备 技 术 f off-se a e 发 布 4 方 标 B 45/T 24 4 术 规 程 a son Ple 2022 - 0 布 45 标准 4 6 202 2 程 euro

2、tus 0 2 - 28 实 准 2 实 施DB 45 /T 2 44 6 20 22 II 前言 本文件按照GB/ T 1 .12 0 20标准化工作导则 第1部分：标 准化文件的 结构和起草 规则的规 定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由广西壮族自治区农业科学院提出并宣贯。 本文件由广西农业种植业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：广西壮族自治区农业科学院微生物研究所、玉林市微生物研究所。 本文件主要起草人： 陈雪凤、 吴圣进、 韦仕岩、 卢玉文、 郎宁、 苏 启臣、 王灿琴、 吴小建、 陈 国龙。 DB 45 /T 2 44

3、 6 20 22 1 反季节秀珍菇菌种制备技术规程 1 范围 本文件界定了秀珍菇、 反季节秀珍菇、 种源的术语和定义， 规定了制备环境、 设施设备要求、 质量 要求及种源组织分离、 母种复壮与扩繁、 原种、 栽培种生产、 杂菌及害虫的检验判定等各阶段的操作技 术要求。 本文件适用于广西行政区域内反季节秀珍菇菌种的制备。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件； 不注日期的引用文件， 其最新版本 （包括所有的修改单） 适用于本 文件。 GB 5 74 9 生 活饮用水卫生标准 GB /T 1

4、 27 28 食用菌术语 NY /T 5 28 食用菌菌种生产技术规程 NY 5 09 9 无 公害食品 食用菌栽培基质安全技术要求 3 术语和定义 GB /T 1 27 28 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3 .1 秀珍菇 P leu ro tu s pu lmo na ri us 在分类学上属于真菌门、 担子菌纲、 伞菌目、 侧耳科、 侧耳属； 中文名： 肺形侧耳种， 商品名或俗 称凤尾菇、秀珍菇。子实体单生或散生，菌盖灰白至灰褐（黑）色。 3 .2 反季节秀珍菇 o ff -s eas on P le ur otu s pu lm on ari us 自然条件下冬季出菇的秀珍菇

5、品种， 通过人工调节栽培条件， 能在夏季正常生产或栽培的秀珍菇品 种。 3 .3 种源 s ee d s ou rc e 从野外或栽培场地采集，可以用来分离提纯繁殖材料的食用菌菌丝、子实体或孢子。 4 菌种制备环境 制备环境应符合NY /T 5 2 8的规定，用 水应 符合GB 5 74 9的规定。 5 设施设备要求 DB 45 /T 2 44 6 20 22 2 5 .1 基本设施 冷却室 、 接 种 室 、培养 室 应通 风 、 洁净 ，可 控温 、 控湿 。 5 .2 主要设备 应 具 备 高压灭 菌 锅 、 超净 工作 台或接 种 箱 、 空调 、 除湿 机、 培养 架 、 恒温 培养

6、 箱 、 冰箱 、 显 微 镜 等。 生产量 大 的菌种 厂 配备 搅拌 机、 装瓶或装袋 机。 6 菌种制作方法 6 .1 总体技术要求 总体 技术要求 如 下： a) 接 种所 需 工 具 及环境要提前 灭 菌 或消毒 ； b) 采 用适 宜 的培养基； c) 接 种操作全程要求无菌操作； d) 繁 殖 的 每批 菌种应 做好 生产 记 录； e) 菌 丝 培养期 间温差 应 6 ； f) 每批 菌种应 贴 有标 签 。 6 .2 种源组织分离方法 6 .2 .1 种源采集时间 采集时间为 5 6 月 ， 采集 第1 潮或 第2 潮 菇。 6 .2 .2 种源要求 选择 出菇 快 、 均匀

7、整齐 、产 量 高且 菇 形完整 、无 病斑 、 无虫口、 品种 特征明显 ，不 含 杂质的秀珍菇 子 实体 。 6 .2 .3 分离培养基 采 用 PS A 加富 培养基 （ 见 附录 A） 平板 进行分离。 母种培养基 灭 菌条件 为 0. 11 MP a （1 21 ）下 灭 菌3 0 mi n 。 6 .2 .4 切块接种 用75 酒精 对种源进行 表面消毒后 ， 将 种源 沿 菌 柄 中 心纵向掰 成 两半 ， 用无菌 解剖刀 在菌 盖 与菌 柄 交 界 处 中 心 部位 切取 （4 6） mm （4 6） mm 菌 肉 组织 接到平板 上，于2 5 29 恒 温 培养。 6 .2

8、.5 菌种纯化 组织 块 培养4 d 5 d ， 长 出 白色丝 毛状 菌 丝体 ，检 查淘汰 有杂 菌的菌 落 。 选取 菌 丝健 壮、 洁白 、 均 匀 的菌 落 ，用 接 种 铲取 菌 丝 前 端 ， 移接到P S A 综合 培养基 试管斜面 ，于2 7 培养7 d 8 d ， 选取 菌 丝健 壮、 洁白 、 均匀 的 试管斜面做为 母种 保存 。 6 .2 .6 出菇试验观测 DB 45 /T 2 44 6 20 22 3 分离所得母种进行培养，栽培出菇试验重复3次 ，各项性状优良稳定的母种可进入生产使用。 6 .3 母种复壮与扩繁技术 6 .3 .1 复壮 从冰箱取出保存的母种于25

9、 放置 0.5 d 1 d后，用 接种铲取 （46） mm （46） mm 菌丝块接到 PS A 加富培养 基或淀粉加富培养基（见 附录A）平板 上，于2 5 29 培养 5 d 6 d ， 观察接种 点 菌 丝 情况，挑出无杂菌、菌丝健壮、洁白、整齐的菌落作为母种进行扩繁。 6 .3 .2 扩繁 用 接 种 铲切取健壮菌落 前 端 菌 丝块移接到P S A 综合 培养基试管斜面，于2 7 恒温培养6 d8 d ，菌 丝长满斜面后，即可用于生产。菌种扩繁移植传代次数不宜超过3代。 6 .3 .3 检查 母种扩繁培养期间，应逐支正反面全面检查2次 ，剔除污染、长势差、色泽异常的菌落。 6 .4

10、原种、栽培种生产技术 6 .4 .1 生产时间 原种生产时间宜安排在1 0月下旬11月，栽培种生产时间宜安排在11月 12月。 6 .4 .2 培养基容器要求 培养基容器应满足以下要求： a) 盛装容器应耐高压（0.1 5 MP a ）、耐高 温 （12 6 13 0 ）； b) 原种用玻璃瓶盛装、栽培种用聚丙烯塑料袋盛装； c) 瓶 子 体积宜 50 0 mL 75 0 mL ， 塑料袋为聚丙烯塑料袋，规 格( 13 cm 15 c m )( 26 cm 28 cm ) 0.06 cm； d) 塑料颈圈、棉塞或无棉塑料盖，能满足滤菌和透气要求； e) 棉塞应符合 NY /T 5 28 规 定

11、。 6 .4 .3 培养基制作 培养基 配方（ 见附录 A）。阔叶 木屑、棉籽壳、桑枝屑应于前一天预湿，麦麸、轻质碳酸钙、石 灰等装袋前加入并拌均匀。原料含水量为 58 62， pH 值为 78。 6 .4 .4 灭菌 培养基配制 好后，在4 h 内进行装袋 并 高压灭菌， 保持压力 0.14 MPa 0.1 5 MPa （ 温度为 12 6 12 8 ），维持 2 h 2.5 h 。 6 .4 .5 冷却和接种 待瓶 （ 袋） 料温冷却至 30 以下 即可接种。 用无菌接种勺 （镊子） 先去掉母种前端或原种表面 老 菌块，再进行接种。接种量为 1 支 母种接 5 6 瓶原种，75 0 mL

12、原种 接 4555 袋栽培 种。菌种块要紧 贴培养料。 6 .4 .6 培养 DB 45 /T 2 44 6 20 22 4 接 种 后 ，原种、栽培种 放置 无菌培养 室 培养。培养 室宜黑 暗 ， 温度稳 定在25 27 ， 空气 相 对 湿度 60 70 。 6 .4 .7 检查 菌种培养期 间至 少进行3 次逐瓶 （ 袋 ）检 查 ， 即接 种 后 3 d 4 d 菌 丝 未封 面 前、 菌 丝长至瓶 （ 袋 ） 身 1/3 1/2 处 、菌 丝长至瓶 （ 袋 ） 身 2/3 至满 瓶 （ 袋 ） 前各检 查 1 次 ， 清理 菌 丝 生 长异 常 或污染 的 瓶 （ 袋 ）。 6 .

13、4 .8 菌种存放 合格 的菌种 放 在4 6 下 避光 保存 ， 保存 期 限 1 个 月 。 7 质量要求 7 .1 感官要求 7 .1 .1 容器要求 瓶 （ 袋 ）应 完整 ，无 损 ， 棉塞 、 塑料盖 应 干燥 、 洁净 、 松紧 适 度 ，应 符合透气 和 滤 菌要求， 无 霉 点 霉 斑 。 7 .1 .2 容积要求 母种培养基 灌 入 量 为试管总 容 积 的1 /5 1/4 ， 顶 端 距 棉塞 40 mm 50 mm 。原 种、栽培种培养基上 表 面 距 瓶(袋) 口的 距 离45 mm 55 mm 。 7 .1 .3 菌种外观 母种菌 丝 应 长满斜面 ， 原 种、 栽

14、培种菌 丝 应 长满瓶或袋 。菌 丝体 洁白 、 色泽一 致 、 均匀健 壮、 舒展 、 浓密 、菌 落 边缘 整齐 ，无 角变 ，无 抑 制 拮抗线 ， 无杂菌菌 落 ，无 菌 丝 分 泌 物。 原种、 栽培种培养物 表面 分 泌 物 允许 有少量无 色或透明 浅黄 色 水 珠 ， 不能有 黄 色或 黄 褐色 水 珠 ， 原种、 栽培种原基 总 量不 超 过5 。 7 .1 .4 培养基外观 培养基不 干缩 ，无 积 水、 颜 色均匀 、无 暗 斑 、无 色 素 。 7 .1 .5 气味 有秀珍菇菌种 特 有的 清香味 ，无 酸 、 臭 、 霉 等 异 味 。 7 .2 菌丝生长速度 在25

15、 29 下培养，母种6 d 8 d 长满斜面 ，原种、栽培种25 d 32 d 长满瓶或袋 。 8 杂菌及害虫的检验及判定 8 .1 杂菌检验及判定 8 .1 .1 感官检测 若 出 现 以下 三 种 情况 之 一 ，则判定 为 有杂菌 污染 ： a) 培养物 表面 有 光滑 、 湿 润 的 粘稠 物； DB 45 /T 2 44 6 20 22 5 b) 在棉花塞、胶塞、瓶颈接口处或培养基面上有与正常菌丝颜色不同的杂菌斑点； c) 打开菌种瓶、袋或试管塞，有酸、臭等异味。 8 .1 .2 镜检 在培养物异样部位取少量菌丝体制片，于 显微镜下观察， 若有不同形态菌丝或孢子存在的， 判定为 杂菌

16、污染。 8 .1 .3 培养检测 8. 1. 3. 1 细菌培养检测：取菌种上、中、下三个部位黄豆粒大小的菌块，接入 15 mL 20 mL 三角瓶肉 汤培养基中，在 28 30 条件下 振荡培养 1 d 2 d，观察 培养液是否混浊，若培养液混浊则判定有 细菌污染。 8. 1. 3. 2 霉菌培养检测： 取菌种上、 中、 下三个 部位黄豆粒大小的菌块接到 PD A 平板 上， 在2 8 30 条件下培养 3 d5 d，观察 菌丝颜色、菌丝长势、菌落特征、有无杂菌孢子产生等。 8 .2 害虫检验及判定 从待检菌种的不同部位取出少量培养物， 放于白色搪瓷盘上， 均匀铺开，在 放大镜或解剖镜下观察

17、 是否有害虫的卵、幼虫、蛹或成虫。 DB 45 /T 2 4 4 6 A .1 母 种 培 A. 1. 1 NY A. 1. 2 PS A 馏水1 00 0 m A. 1. 3 PS A 琼脂2 0 g， 蒸 A. 1. 4 淀 粉 0. 5 g， 琼 脂 A .2 原 种 、 棉籽 壳 0. 5 1 A .3 检 验 培 A .3 .1 肉 汤 牛肉 膏 A. 3. 2 PD A 去皮 马 4 6 20 22 培 养基 50 99 规定 的 A 综 合培养 基 m L，p H= 6. 5 A 加富培养 基 蒸 馏水1 00 0 粉 加富培养 基 脂 20 g， 蒸 馏 、 栽培种培 养 壳

18、40 50 ，含水量5 8 培 养基 汤 培养基 膏 3 g， 蛋 白 胨 A 培养基 马 铃薯20 0 g， 基质适用于 本 基 ：去皮马 铃 7 .5。 基 ：去皮马 铃 0 m L，p H= 6. 5 基 ：去皮马 铃 馏 水1 00 0 mL ， 养 基 ，桑枝、阔 62 ， p 胨 10 g， 氯 化 钠 葡萄糖 2 0 g 附 常用 本 文件。 薯200 g， 蔗 铃 薯200 g， 蔗 5 7 .5。 铃 薯2 00 g， 可 pH =6 .5 7 . 叶木屑3 0 p H= 78。 钠 5 g， 蒸 馏 ，琼脂20 g， A A 附 录A （规范性） 培养基及配 蔗 糖20 g

19、， 琼 脂 蔗 糖20 g， 蛋 可 溶性淀粉2 . 5。 5 0，麦 麸 馏 水1 00 0 mL， 蒸馏水1 0 0 方 脂 20 g，磷 酸 蛋 白胨2 g， 磷 0 g ，蛋白 胨 麸 15 20 pH =7 .0 7 . 0 0 mL ，pH 自 然 酸 二氢钾1.0 磷 酸二氢钾1 . 2 g ，磷酸 二 ，石灰1 . 5。 然 。 g，硫酸镁 0 0 g，硫酸 镁 二 氢钾1 .0 g， 2 ，轻 质 0 .5 g，蒸 镁 0.5 g, 硫酸镁 质 碳酸钙 中华人民共和国广西地方标准 反季节秀珍菇菌种制备技术规程 DB 45/T 2446 2022 广西壮族自治区市场监督管理局统一印刷 版权专有 侵权必究