DB33 T 2405-2021 猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法.pdf

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1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 33 浙江省地方标准 DB33/T 2405 2021 猪德尔塔 冠状病毒 和猪流行 性腹泻病 毒双 重荧光 RT-PCR 检测 方法 Dual real-time RT-PCR method for detection of porcine deltacoronavirus and porcine epidemic diarrhea virus 文稿版次选择 （本稿 完成 日期 ：） 2021 - 12 - 12 发 布 2022 - 01 - 12 实施 浙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB33/T 24052021 I 前 言

2、 本标准 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工作 导则 第1 部分： 标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定 起草。 请注意 本标 准的 某些 内容 可能涉 及专 利。 本标 准的 发布机 构不 承担 识别 这些 专利的 责任 。 本标准 由浙 江省 农业 农村 厅提出 。 本标准 由浙 江省 畜牧 兽医 和饲料 标准 化技 术委 员会 归口。 本标准 起草 单位 ：浙 江大 学、浙 江省 动物 疫病 预防 控制中 心。 本标准 主要 起草 人 ： 赵 灵 燕、 冯肖 肖、 吴贇 竑 、 李 肖 梁、 方维 焕、 单颖 、 谢荣 辉 、 徐 计东 、 毕 淑珍 、 刘爱军 、吴 雪

3、军 、黄 晓兵 、周蕾 、章 杭建 。 DB33/T 24052021 1 猪 德尔塔 冠状病毒 和猪流 行性腹泻 病毒双 重荧 光 RT-PCR 检测方 法 1 范围 本标准 规定 了猪 德尔 塔冠 状病毒 和猪 流行 性腹 泻病 毒双重 荧光RT-PCR 检 测方 法的 术 语和 定义 、 缩 略 语、仪 器、 耗材 和试 剂 、 样品采 集和 处理 、荧 光RT-PCR 操 作程 序 、 结果 判定 及 生物安 全措 施 。 本标准 适用 于猪 德尔 塔冠 状病毒 和猪 流行 性腹 泻病 毒的核 酸检 测。 2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构

4、 成本 标准必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本标 准； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用 于 本 标准。 GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB 19489 实验 室 生物 安全通 用要 求 NY/T 541 兽医 诊断 样品 采集、 保存 与运 输技 术规 范 NY/T 1948 兽 医实 验室 生 物安全 要求 通则 SN/T 4835 实 验室 生物 废 弃物管 理要 求 3 术语与 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 标准。 3.1 RT-

5、PCR 反转录 聚合 酶链 式反 应（reverse transcription-polymerase chain reaction ），将RNA 的反 转录 (RT)和cDNA 的聚 合酶 链式 扩增(PCR) 相结 合的 技术 。 4 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 标准 。 -Actin ： 肌动蛋 白，是 细胞 的 一种重 要骨架 蛋白 ，其在 不同物 种之间 高度 保守， 是PCR 常用的 内 部参照 。 Ct 值： 每个 反应 管内 的荧 光信号 量达 到设 定阈 值时 所经历 的循 环数 （cycle threshold）。 DEPC ： 焦磷 酸二 乙酯 （diethyipy

6、ocarbonate）。 DNA 酶 ：脱 氧核 糖核 酸酶 （deoxyribonuclease ）。 PBS ： 磷酸 盐缓 冲液 （phosphate buffered solution ）。 PDCoV ：猪 德尔 塔冠 状病 毒 （porcine deltacoronavirus）。 PEDV ： 猪流 行性 腹泻 病毒 （porcine epidemic diarrhea virus ）。 DB33/T 24052021 2 RNA： 核糖 核酸 （ribonucleic acid）。 RNA酶 ：核 糖核 酸酶 （ribonuclease）。 RT-Enzyme Solution

7、 ：反 转录酶 溶液 （reverse transcription enzyme solution）。 Taq酶：Taq DNA 聚合 酶（Taq DNA polymerase ）。 Taqman 探针 ：一 种检 测寡 核苷酸 的荧 光探 针。 TE缓冲 液：Tris-EDTA 缓 冲 液（tris-EDTA buffer）。 5 仪器 5.1 荧光PCR 检测 仪。 5.2 高速台 式冷 冻离 心机 ：可 控温 至 4 、离 心速 度可 达 12 000 r/min 以上 。 5.3 组织研 磨器 或者 研钵 。 5.4 分析天 平。 5.5 生物安 全柜 。 5.6 冰箱 ： 可温 控

8、在2 8 和-20 -40 。 5.7 超低温 冰箱 ：可 控温 至-70 以 下。 5.8 微量移 液器 ：2 L 、10 L 、100 L 、200 L 、1 000 L， 并配 备与 移液 器匹 配 的吸头 。 5.9 高压灭 菌锅 和干 燥箱 ：可 温控 至 160 。 6 耗材和 试剂 6.1 无RNA 酶的 1.5 mL 离心 管 。 6.2 无RNA 酶的 0.2 mL PCR 管 或八联 管及 各种 规格 吸头 。 6.3 除非另 有说 明， 在检 测中 使用的 试剂 均为 分析 纯， 实验室 用水 应符 合GB/T 6682 的 要求 。 6.4 Trizol ：商 品 化R

9、NA 抽提 试剂，2 8 保 存。 6.5 RNA 提 取试 剂盒 ：商 品化RNA 病 毒核 酸提 取试 剂盒 。 6.6 氯仿和 异丙 醇：-20 预 冷。 6.7 75%乙 醇： 无水 乙醇 和双 蒸 水配制 ，-20 预冷 。 6.8 DEPC 水： 参照 附录A 配 制 ，也可 购买 商品 化 DEPC 水。 6.9 PBS（0.01 mol/L ，pH 7.2 ）：参照 附录 A 配制 ，也 可购买 商品 化 PBS 。 6.10 引物 和TaqMan 探针 ：其 序 列 见附录 B ，由 生物 公司 合成， 用 TE 溶 液溶 解并 稀 释至 100 mol/L 存储液 ，-20

10、 保存 备用 ；根据 需要 配制 成 10 mol/L 工 作液 ，-20 保 存供 检测使 用。 6.11 病毒阳 性对 照和 阴性 对照 ： 猪德尔 塔冠 状阳 性对 照样 品和猪 流行 性腹 泻阳 性对 照样品 分别 为携 带 检测靶 序列 的质 粒（ 质粒 及其检 测靶 序列 见附录 C ），阴 性对 照样 品为 空质 粒。 6.12 内参对 照阳 性对 照样 品和 阴性对 照样 品： 内参 对照 阳性对 照样 品为 带有 猪-actin 基因 的质 粒； 内参对 照阴 性对 照样 品为 空质粒 。 7 样品采 集和 处理 7.1 采样工 具 7.1.1 手术刀 、剪 刀、 镊子 ，经

11、121 湿热 灭菌30 min 。 7.1.2 一次性 无菌 采样 拭子 和采 样管 。 DB33/T 24052021 3 7.1.3 组织研 磨器 或者 研钵 ， 经160 干热 灭 菌2 h。 7.2 样品采 集 7.2.1 粪便或 肠内 容物 采集 将一次 性无 菌采 样拭 子用 无菌PBS 浸 湿后 ， 蘸取 粪便 或肠内 容物 （ 不少 于0.5 g ） ， 置 于无 菌采 样管 中备用 。 7.2.2 肛拭子 采集 大 猪 使 用保 定 器保 定 ，小猪 可 以 双手 保 定， 将 一次性 无 菌 采样 拭 子用 无菌PBS 浸 湿 后 ，探 入 直肠2 cm 3 cm 、 旋转

12、3 次5 次 后，取 出含 有直 肠内 容物 肛拭子 ，置 于无 菌采 样管 中备用 。 7.2.3 组织样 品采 集 用7.1.1 处 理过 的器 械， 取 肠道组 织（ 不少 于5 g） ， 置于无 菌采 样管 中备 用。 7.3 样品保 存和 运输 上述采 集的样品 宜立即 进行检测 。不能立即检测 的样品， 在2 8 条件下保 存不应 超过24 h， -25 -15 条件 下保存 应不超 过1个 月，-70 以下 条件 保存 应 不超 过6 个 月。样 品运送 采用 低温保 存进行 运输 ，并 在规 定温 度下的 保存 期内 送达 。 7.4 样品处 理 7.4.1 粪便或 肠内 容物

13、 取0.5 g2.0 g 粪便 或肠 溶 物 加入500 L 无菌PBS ， 冻 融1 次 2次 ， 充分 涡旋 震 荡1 min ， 于4 下 以 3 000 r/min 转速 离心5 min ，取上 清装于1.5 mL 灭菌 管 ，用 于后 续的 核酸 提取 。 7.4.2 肛拭子 肛拭子采样管中加入500 L无菌PBS ，冻融1次2 次，充分涡旋震荡1 min ，于4 下以3 000 r/min 转速离心5 min ，取 上清 装于1.5 mL灭 菌管 ，用 于后 续的核 酸提 取。 7.4.3 组织样 品 取1.0 g 2.0 g组 织，剪 碎 ，加入1 mL无菌PBS 进行研 磨，制

14、 备组织 匀浆， 冻融1 次2次， 于4 下 以8 000 r/min转速 离心5 min ，取 上清 装于1.5 ml灭 菌管 ， 用于 后续 的核 酸提 取。 8 荧光 RT-PCR 操 作程 序 8.1 RNA 提取 8.1.1 按下列 步骤完 成RNA 提取， 并用无RNA酶 活性的DNA酶 处理， 也可采 用商品 化的 病毒RNA 提取 试剂 盒。 8.1.2 取n个 灭菌 的1.5 mL 离心 管 （n为 待检 样品 数） ，对 每 个离心 管进 行编 号 。 8.1.3 每管加 入750 L Trizol ， 加入被 检样 品250 L， 用 力上下 反复 颠倒 数次 或涡 旋振

15、荡30 s ， 静 置5 min。 再加 入200 L 预冷 的 氯仿， 震荡 混匀 ，静 置5 min ，于4 条件 下 以12 000 r/min 转速 离心15 min 。 DB33/T 24052021 4 8.1.4 取与8.1.2 中 相同数量 的灭菌1.5 mL离心管 ，并对每个 离心管进 行编号。 取8.1.3 中 离心后的 上 清液（ 注意 不要 吸出 中间 层）转 移至 相应 的管 中， 加入等 体积 预冷 异丙 醇， 混匀， 静置30 min 。 8.1.5 于4 条件 下以12 000 r/min 转速 离心15 min ， 弃上 清 ， 缓 缓加 入1 mL 75%

16、预冷 乙 醇， 颠倒 洗涤 沉 淀及管 壁。 8.1.6 于4 条件下以12 000 r/min 转速 离心10 min ，弃 上清，室 温条件下干燥 后，加入30.0 L DEPC 处理水 ， 轻 轻混匀 ， 溶 解 管中的RNA，以4 000 r/min 转速离 心10 s， 置 于冰 上 保存备 用。 提 取的RNA 应在 2 h内 进行 荧光RT-PCR 扩 增 ，若需 长期 保存 ，应 置于-70 以下 条件 的冰 箱保 存 。 8.2 荧光 RT-PCR 反应 8.2.1 反应体 系的 配制 在 试 剂 配制 区 分别 配 制病毒 检 测 反应 体 系和 内 参对照 检 测 反应

17、体 系。 病 毒检测 反 应 管数 为n+3 （n 为待检 样品数 ，包 括1份PEDV阳性 对照、1份PDCoV 阳 性对照 和1份 阴性对 照） ， 反应体 系组成 见下 表1。 内参对 照检 测反 应管 数为n+2 （n 为待 检样 品数 ，包 括1份内 参对 照阳 性对 照和1 份内参 对照 阴性 对照 ）， 反应体 系组 成见 下表2。 各 反应液 体积 宜按 多1 管进 行 配制 ， 且 在使 用RT-Enzyme Solution 时 至少 用1 L。 配制反 应液 应在 冰盒 中进 行。 表1 PDCoV 和PEDV 双重 荧光 RT-PCR 反应 体系 组 分 1 个检测反应

18、的加入量 / L 2 R T-PCR Reaction Mix 10.0 200RT-Enzyme Solution 0.1 PDCoV 上游引物（PDVF ） 0.4 PDCoV 下游引物（PDVR ） 0.4 PDCoV 探 针（PDVP ） 0.1 PEDV 上游引物（PEDVF ） 0.4 PEDV 下游引物（PEDVR ） 0.4 PEDV 探 针（PEDVP ） 0.1 DEPC 处理水 3.1 合计 15.0 表2 内参对 照荧 光 RT-PCR 反 应 体系 组 分 1 个检测反应的加入量 / L 2 R T-PCR Reaction Mix 10.0 200 R T-Enzy

19、me Solution 0.1 上游引物（ACTF ） 0.4 下游引物（ACTR ） 0.4 探 针（ACTP ） 0.1 DEPC 处理水 4.0 合计 15.0 8.2.2 反应液 的分 装 DB33/T 24052021 5 将8.2.1 中 配制 的荧 光RT-PCR 反应 液充 分混 匀， 按照 每管15.0 L分 装于 无RNA 酶的0.2 mL PCR 管 内， 将PCR 管置 于96 孔板 上， 按 顺序加 样并 做好 标识 ，转 移至核 酸提 取区 。 8.2.3 加样 在核酸提取区进行。按照阴性、样品RNA溶液或阳性对照的顺序加入各5.0 L 溶液，盖上盖子，轻 微震荡

20、混匀 ，以500 r/min 1 000 r/min转 速离 心30 s， 转 移至 检测 区。 8.2.4 上机检 测 8.2.4.1 荧 光通 道设 置 在检测 区进 行。 将8.2.3 中 离心后 的PCR 管 放入 荧光PCR 检测 仪中 ， 设 定荧 光检 测 通道。 其中 ，PDCoV 检测通 道为FAM ，PEDV 检 测 通道为Cy3 ；内 参对 照检 测 通道为FAM 。 8.2.4.2 循 环条 件设 置与 检测 反应条 件为：50 反转录10 min ；95 预变 性30 s ；然后95 变 性5 s ，60 退火40 s， 共循环45 次，每 次在60 40 s时 收

21、集荧光 信号； 最后40 复 性30 s 。检测 结束 后，保 存结果 ，根据 收集 的荧 光 曲线和Ct值 判定 结果 。 9 结果判 定 9.1 阈值设 定 阈 值 设 定原 则 根据 仪 器噪声 情 况 进行 调 整， 以 阈值线 刚 好 超过 正 常阴 性 产品扩 增 曲 线的 最 高点 为 准。 9.2 成立条 件 9.2.1 PDCoV 阴性 对照 ：FAM 通 道 无报 告Ct 值或 无典 型的S 型扩增 曲线 。PEDV 阴性 对 照：Cy3 通 道无 报告 Ct 值 或无 典型 的S 型 扩增曲 线。 9.2.2 PDCoV 阳性 对照 ：FAM 通道 Ct 值30， 且 扩

22、增 曲线 为典型 的S 型。PEDV 阳 性 对照 ：Cy3 通道 Ct 值30 ，且 扩增 曲线 为典 型的 S 型。 9.2.3 内参对 照阴 性对 照：FAM 通道无 报 告Ct 值或 无典 型 的 S 型 扩增 曲线 。 9.2.4 内参对 照阳 性对 照：FAM 通道 Ct 值30 ，且 扩增 曲 线为典 型 的 S 型。 9.2.5 内参对 照检 测：FAM 通道Ct 值33， 且扩 增曲 线为 典型 的 S 型。 9.2.6 检测结 果判 定需 同时 满 足9.2.1 9.2.5 。 否则 ，本 次检测 无效 ，应 重新 进行 。 9.3 结果判 定 9.3.1 被检样 品检测

23、结果中FAM通道Ct值 35， 且出现 典型 扩增曲 线，报 告为PDCoV 核 酸阳性 。被检 样 品检测 结果 中Cy3通道Ct 值 30， 且出 现典 型扩 增曲 线，报 告为PEDV 核酸 阳性 。 9.3.2 被检样 品检 测结 果中FAM 通道35Ct值37 ，且 出现 典型扩 增曲 线， 报告 为可 疑，应 重复 试验 。 重复试 验结果 仍为可 疑， 报告为PDCoV 核酸阳 性， 否 则报告为PDCoV 核酸 阴性 。 被检样 品检测 结果 中Cy3 通道30 Ct 值32， 且出 现典型 扩增 曲线 ， 报 告为 可疑， 应重 复试 验。 重复 试验结 果仍 为可 疑， 报

24、 告 为 PEDV核 酸阳 性， 否则 报告 为PEDV 核酸 阴性 。 9.3.3 被检样 品检测 结果中FAM通道Ct值 37， 且无典 型扩 增曲线 ，报告 为PDCoV 核 酸 阴性。 被检样 品 检测结 果中Cy3 通道Ct值 32，且 无典 型扩 增曲 线， 报告为PEDV 核酸 阴性 。 DB33/T 24052021 6 10 生物安 全措 施 本 标 准 中样 品 的采 集 、处理 、 保 存、 运 输、 检 测和废 弃 物 处理 等 涉及 到 的生物 安 全 措施 应 按照GB 19489 、NY/T 541 、NY/T 1948 、SN/T 4835 等要 求进 行。 D

25、B33/T 24052021 7 附 录 A （资料 性） 溶液配 制 A.1 DEPC 水 每升去 离子 水中 加入 1 mL DEPC ， 充分 混匀 ，37 放置 12 h 以 上， 再经 121 高压灭 菌 15 min 后 备用。 A.2 PBS （0.01 mol/L ，pH 7.2 ） 用 800 mL 蒸馏 水溶 解 8 g NaCl ，0.2 g KCl ，1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4 。用 HCl 调节溶液 pH 至 7.2 ，加 水至1 L 。分 装 后经 121 高压 灭 菌15 min 后备 用。 DB33/T 24052021 8 用

26、 800 mL 蒸馏 水溶 解8 g NaCl ，0.2 g KCl ，1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4 。用 HCl 调 节溶 液 pH 至7.2 ，加 水至1 L 。分 装 后经121 高 压灭 菌 15 min 后 备用 。 附 录 B （规范 性） 引物和 探针 引物、 探针 的名 称和 序列 见表B.1 。 表B.1 引 物、 探针 的名 称与序 列 检测靶标 名 称 序 列 PDCoV 上游引物（PDVF ） 5-CGACCACATGGCTCCAATTC- 3 下游引物（PDVR ） 5-CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT- 3 探 针（PDVP

27、 ） 5-FAM-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGC-ZEN- 3 PEDV 上游引物（PEDVF ） 5 -CGCAAAGACTGAACCCACTAACCT-3 下游引物（PEDVR ） 5 -TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT-3 探 针（PEDVP ） 5 -Cy3 TGTTGCCATTACCACGACTCCTGC-BHQ2-3 内参对照 上游引物（ACTF ） 5-CTCGATCATGAAGTGCGACGT - 3 下游引物（ACTR ） 5-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGTC - 3 探 针（ACTP ） 5-FAM-ATCAGGAAGGA

28、CCTCTACGCCAACACGG -TAMRA- 3 DB33/T 24052021 9 附 录 C （规范 性） 质粒及 其检 测靶 序列 C.1 质粒 C.1.1 质粒基 因 组 图谱 对照样 品使 用的 质粒 基因 组图谱 见图C.1 。 图C.1 质 粒基 因组 图谱 C.1.2 质粒序 列 TGGAGGCAAGGCCTGCAAAATGCAATACTGCAAGCATTGGGGAGTCAGACTCCCATCAGGTGTCTGGTTCGAGATGGCTGATAA GGATCTCTTTGCTGCAGCCAGATTCCCTGAATGCCCAGAAGGGTCAAGTATCTCTGCTCCATC

29、TCAGACCTCAGTGGATGTAAGTCTA ATTCAGGACGTTGAGAGGATCTTGGATTATTCCCTCTGCCAAGAAACCTGGAGCAAAATCAGAGCGGGTCTTCCAATCTCTCCAGTGGDB33/T 24052021 10 ATCTCAGCTATCTTGCTCCTAAAAACCCAGGAACCGGTCCTGCTTTCACCATAATCAATGGTACCCTAAAATACTTTGAGACCAGATA CATCAGAGTCGATATTGCTGCTCCAATCCTCTCAAGAATGGTCGGAATGATCAGTGGAACTACCACAGAAAGGGAACT

30、GTGGGATGAC TGGGCACCATATGAAGACGTGGAAATTGGACCCAATGGAGTTCTGAGGACCAGTTCAGGATATAAGTTTCCTTTATACATGATTGGAC ATGGTATGTTGGACTCCGATCTTCATCTTAGCTCAAAGGCTCAGGTGTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCC TGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGC TCTATTGCCTCTTTTTTCTTTA

31、TCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAA AGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGTAACTCAAATCCTGCACAACAGATTCTTCATG TTTGGACCAAATCAACTTGTGATACCATGCTCAAAGAGGCCTCAATTATATTTGAGTTTTTAATTTTTATGAAAAAAAAAAAAAAAAA CGGAATTCACCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGC

32、TAATGCCCTGGCCCACAAGTATCACTAAGCTCG CTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCA TCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAATGATGTATTTAAATTATTTCTGAATATTTTACTAAAAAGGGAATGTG GGAGGTCAGTGCATTTAAAACATAAAGAAATGAAGAGCTAGTTCAAACCTTGGGAAAATACACTATATCTTAAACTCCATGAAAGAAG

33、 GTGAGGCTGCAAACAGCTAATGCACATTGGCAACAGCCCCTGATGCCTATGCCTTATTCATCCCTCAGAAAAGGATTCAAGTAGAGGC TTGATTTGGAGGTTAAAGTTTTGCTATGCTGTATTTTACATTACTTATTGTTTTAGCTGTCCTCATGAATGTCTTTTCACTACCCATT TGCTTATCCTGCATCTCTCAGCCTTGACTCCACTCAGTTCTCTTGCTTAGAGATACCACCTTTCCCCTGAAGTGTTCCTTCCATGTTT TACGGCGAGATGGTTTCTCCTCGCCTGGCCAC

34、TCAGCCTTAGTTGTCTCTGTTGTCTTATAGAGGTCTACTTGAAGAAGGAAAAACAG GGGGCATGGTTTGACTGTCCTGTGAGCCCTTCTTCCCTGCCTCCCCCACTCACAGTGACCCGGAATCCCTCGACATGGCAGTCTAGCA CTAGTGCGGCCGCAGATCTGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAG GCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCA

35、GCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAA AGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCC GACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTG TCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGC TGGGCTGTG

36、TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGA CTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCT AACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGAT CCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTT

37、GCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCC TTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTC ACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAA TCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAA

38、CTACGATACGGGA GGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCC GGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTT CGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTC CGGTTCCCAACGATCAAGG

39、CGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGA AGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTG TGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATAC CGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCG

40、GGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGA TCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAA GGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTA TCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGA

41、AAA GTGCCACCTGACGTGGATCCCCTGAGGGGGCCCCCATGGGCTAGAGGATCCGGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAAATTAGTCAG CCATGAGCTTGGCCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGA CATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTA CGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCC

42、AACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGDB33/T 24052021 11 GACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCC CCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCT ACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAG

43、TACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCC AAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCA TTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCC ATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCCCTCGAAGCTTACATGTGGTACCGAG

44、CTCGGATCCTG AGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAG TAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTT TATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAA TAACAGTGATAATTTCTGGGT

45、TAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTT TCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCT AGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTT TGGCAAAGCACGTGAGATCTGAATTCTGACACTATGAAGTGCCTTTTGTACTTA

46、GCCTTTTTATTCATTGGGGTGAATTGCAAGTTCA CCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCAGATTTAAATTG GCATAATGACTTAATAGGCACAGCCTTACAAGTCAAAATGCCCAAGAGTCACAAGGCTATTCAAGCAGACGGTTGGATGTGTCATGCT TCCAAATGGGTCACTACTTGTGATTTCCGCTGGTATGGACCGAAGTATATAACACATTCCATCCGATCCTTCACTCCATCTGTAGAA

47、C AATGCAAGGAAAGCATTGAACAAACGAAACAAGGAACTTGGCTGAATCCAGGCTTCCCTCCTCAAAGTTGTGGATATGCAACTGTGAC GGATGCCGAAGCAGTGATTGTCCAGGTGACTCCTCACCATGTGCTGGTTGATGAATACACAGGAGAATGGGTTGATTCACAGTTCATC AACGGAAAATGCAGCAATTACATATGCCCCACTGTCCATAACTCTACAACCTGGCATTCTGACTATAAGGTCAAAGGGCTATGTGATT CTAACCTCATTTCCATGGACATCACCTTCTT

48、CTCAGAGGACGGAGAGCTATCATCCCTGGGAAAGGAGGGCACAGGGTTCAGAAGTAA CTACTTTGCTTATGAAAC C.2 检测靶 序列 C.2.1 猪德尔 塔冠 状阳 性对 照样 品检测 靶序 列 CGACCACATGGCTCCAATTCTCACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCTCAAGCTACATGGGCAAGAGCTG C.2.2 猪流行 性腹 泻阳 性对 照样 品检测 靶序 列 CGCAAAGACTGAACCCACTAACCTGGGTGTCAGAAAGGCGTCTGAAAAGCCAATCATTCCAAATTTCTCTCAACAGCTTCCCAG CGTAGTTGAGATTGTTGAACCTAACACACCTCCTACTTCACGTGCAAACTCACGTAGCAGGAGTCGTGGTAATGGCAACAACAGGTCC AGATCTCCAAGTAACAACAGAGGCAA _