WS T 785-2021 人类白细胞抗原基因分型检测体系技术标准.pdf

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1、ICS 11.020CCS C 50中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准WS/T 785 2021WS人 类 白 细 胞 抗 原 基 因 分 型 检 测 体 系技 术 标 准 Technical standard for human leukocyte antigen (HLA) genotyping 2021 -08 - 27 发 布 2022 - 01 -01 实 施中 华 人 民 共 和 国 国 家 卫 生 健 康 委 员 会 发 布 WS/T 785 2021 I 前 言本 标 准 由 国 家 卫 生 健 康 标 准 委 员 会 临 床 检 验 标 准 专 业 委 员 会

2、 负 责 技 术 审 查 和 技 术 咨 询 ， 由 国 家 卫 生健 康 委 医 管 中 心 负 责 协 调 性 和 格 式 审 查 ， 由 国 家 卫 生 健 康 委 医 政 医 管 局 负 责 业 务 管 理 、 法 规 司 负 责 统 筹管 理 。本 标 准 起 草 单 位 ： 北 京 医 院 、 北 京 市 红 十 字 血 液 中 心 、 中 华 骨 髓 库 管 理 中 心 、 浙 江 省 血 液 中 心 、 辽宁 省 血 液 中 心 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 蔡 剑 平 、 张 志 欣 、 肖 尧 、 黑 爱 莲 、 周 晓 阳 、 王 琳 、 戴 大 鹏 、 张 立

3、群 、 朱 发 明 、李 剑 平 。 WS/T 785 2021 II 引 言人 类 白 细 胞 抗 原 （ human leukocyte antigen, HLA） 又 称 移 植 抗 原 ， 与 同 种 异 体 组 织 器 官 移 植 以 及移 植 物 的 排 斥 反 应 相 关 。 存 在 于 细 胞 膜 表 面 的 HLA分 子 可 以 结 合 来 自 细 胞 内 或 细 胞 外 的 肽 ， 形 成 HLA-肽复 合 物 ， 抗 原 递 呈 细 胞 将 该 复 合 物 递 呈 给 T细 胞 引 起 一 系 列 的 免 疫 反 应 。随 着 对 HLA研 究 的 深 入 ， 20世 纪

4、 中 叶 诞 生 的 器 官 移 植 和 造 血 干 细 胞 移 植 技 术 已 成 为 临 床 医 学 治 疗 和拯 救 患 者 生 命 的 重 要 手 段 ， 数 以 百 万 计 的 患 者 通 过 器 官 移 植 和 造 血 干 细 胞 移 植 获 得 了 新 生 。 近 二 十 年 来 ，随 着 对 免 疫 抑 制 剂 、 HLA配 型 、 HLA抗 体 检 测 和 监 测 等 存 活 率 影 响 因 素 的 认 识 ， 器 官 移 植 和 造 血 干 细 胞 移植 存 活 率 得 到 了 显 著 的 改 善 。 HLA组 织 配 型 是 影 响 器 官 移 植 和 造 血 干 细 胞

5、 移 植 存 活 率 及 受 者 生 存 质 量 的重 要 因 素 之 一 。HLA基 因 具 有 高 度 的 多 态 性 ， 决 定 了 所 表 达 的 HLA抗 原 分 子 的 多 态 性 。 随 着 聚 合 酶 链 反 应 (polymerasechain reaction， PCR)技 术 在 临 床 应 用 的 日 益 广 泛 ， 从 20世 纪 80年 代 末 开 始 HLA分 型 已 从 过 去 主 要 采 用血 清 学 和 细 胞 学 检 测 技 术 过 渡 到 以 基 因 分 型 检 测 技 术 为 主 。 基 因 分 型 检 测 技 术 具 有 灵 敏 度 高 、 准 确

6、度 高 、 能 检 测 出 血 清 学 和 细 胞 学 方 法 无 法 检 出 的 基 因 型 别 等 优 点 ， 还 具 有 不 排 斥 原 有 血 清 学 和 细 胞 学 所 阐 述 信息 的 优 点 。 HLA基 因 分 型 检 测 技 术 对 实 验 室 人 员 、 实 验 室 设 置 、 检 测 的 技 术 流 程 以 及 质 量 控 制 等 提 出 了更 高 的 要 求 。 长 期 以 来 我 国 一 直 缺 乏 HLA基 因 分 型 检 测 技 术 体 系 的 规 范 及 要 求 ， 在 一 定 程 度 上 影 响 了 HLA基 因 分 型 整 体 检 测 水 平 的 提 高 和

7、 临 床 器 官 移 植 、 造 血 干 细 胞 移 植 标 准 化 的 进 程 。本 标 准 拟 建 立 适 用 于 我 国 国 情 的 HLA基 因 分 型 检 测 技 术 体 系 的 规 范 及 要 求 ， 旨 在 提 高 我 国 HLA基 因 分型 实 验 室 的 技 术 水 平 ， 更 有 效 地 服 务 于 与 HLA相 关 的 临 床 诊 疗 工 作 。 WS/T 785 2021 1 人 类 白 细 胞 抗 原 基 因 分 型 检 测 体 系 技 术 标 准1 范 围本 标 准 规 定 了 HLA基 因 分 型 检 测 体 系 的 技 术 要 求 。本 标 准 适 用 于 所

8、有 开 展 人 体 标 本 HLA基 因 分 型 检 测 ， 提 供 与 临 床 疾 病 的 诊 疗 、 预 防 、 用 药 监 测 或 者移 植 以 及 人 体 健 康 评 估 相 关 报 告 的 检 测 实 验 室 ， 也 适 用 于 开 展 捐 献 者 HLA基 因 分 型 数 据 入 库 的 检 测 实 验室 和 对 HLA检 测 进 行 质 量 控 制 的 实 验 室 。2 规 范 性 引 用 文 件本 标 准 没 有 规 范 性 引 用 文 件 。3 术 语 和 定 义 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准 。3.1 IPD-IMGT/HLA 数 据 库 Immuno

9、-Polymorphism Database (IPD)-international ImMunoGeneTicsproject (IMGT)/HLA database人 类 主 要 组 织 相 容 性 复 合 物 的 DNA 序 列 数 据 库 ， 包 含 经 世 界 卫 生 组 织 HLA 命 名 委 员 会 命 名 的 HLA等 位 基 因 序 列 。3.2 基 于 直 接 测 序 的 基 因 分 型 sequence based typing,SBT基 于 核 酸 直 接 测 序 技 术 的 基 因 分 型 方 法 。3.3 基 于 序 列 特 异 性 引 物 的 基 因 分 型 se

10、quence-specific primer,SSP 采 用 等 位 基 因 特 异 性 引 物 进 行 核 酸 扩 增 的 基 因 分 型 方 法 。3.4 基 于 序 列 特 异 性 寡 核 苷 酸 杂 交 的 基 因 分 型 sequence-specific oligonucleotide,SSO采 用 特 异 性 序 列 的 寡 核 苷 酸 进 行 核 酸 杂 交 的 基 因 分 型 方 法 。3.5 基 因 型 genotype某 一 基 因 或 一 组 基 因 的 具 体 等 位 基 因 组 合 。3.6 基 因 座 locus基 因 在 染 色 体 上 的 位 置 ， 同 一

11、座 位 上 可 能 有 不 同 类 型 的 等 位 基 因 ； 或 一 段 DNA序 列 在 染 色 体 上 的 位 置 。3.7 擦 拭 检 测 wipe test WS/T 785 2021 2 是 一 种 通 过 擦 拭 物 体 表 面 来 监 测 实 验 室 设 备 和 台 面 是 否 被 核 酸 污 染 的 检 测 方 法 。4 环 境 和 设 施 要 求4.1 环 境4.1.1 实 验 室 应 有 充 足 的 空 间 ， 以 便 所 有 操 作 过 程 和 检 测 分 析 能 够 正 常 运 行 ， 区 域 间 应 避 免 相 互 干 扰 。4.1.2 实 验 室 检 测 区 域

12、应 分 为 “ 清 洁 区 ” 和 “ 污 染 区 ” ， 进 行 有 效 隔 离 并 采 取 措 施 以 防 止 核 酸 交 叉 污染 。4.1.3 应 对 实 验 室 环 境 温 度 、 湿 度 进 行 监 控 并 记 录 。4.2 设 施4.2.1 存 放 试 剂 和 标 本 的 冰 箱 或 者 冰 柜 应 满 足 实 验 的 需 要 。4.2.2 照 明 和 通 风 设 备 及 紧 急 喷 淋 、 洗 眼 器 等 应 急 设 备 应 与 实 验 检 测 要 求 相 适 应 。4.2.3 保 存 记 录 的 设 施 应 满 足 档 案 管 理 要 求 。 使 用 中 的 记 录 和 存

13、档 记 录 的 保 存 位 置 清 晰 可 辨 且 易 于 查 找 。4.2.4 需 要 控 制 温 度 的 仪 器 应 根 据 实 验 要 求 调 节 到 最 佳 温 度 ， 定 期 对 其 温 度 进 行 监 控 和 记 录 。4.2.5 关 键 仪 器 设 备 应 配 置 无 间 断 电 源 。4.2.6 设 备 应 由 经 过 授 权 的 人 员 操 作 ， 专 人 管 理 。4.2.7 设 备 及 其 软 件 应 有 唯 一 性 标 识 ， 并 保 存 记 录 。4.2.8 仪 器 设 备 应 定 期 进 行 维 护 保 养 ， 并 保 存 维 护 、 维 修 记 录 。4.2.9

14、应 根 据 需 求 变 化 或 硬 件 环 境 的 变 化 对 应 用 程 序 进 行 部 分 或 全 部 的 升 级 ， 并 对 升 级 后 的 软 件 进 行性 能 评 估 。 依 据 IPD-IMGT/HLA 数 据 库 的 更 新 ， 至 少 每 年 一 次 对 本 地 HLA 数 据 库 进 行 更 新 ， 并 针 对 更 新后 的 数 据 库 进 行 性 能 评 估 。4.3 生 物 、 化 学 和 物 理 危 险 性4.3.1 生 物 危 险 性所 有 人 类 标 本 （ 包 括 血 样 、 组 织 等 ） 均 应 被 认 作 感 染 性 的 样 本 来 处 置 ， 实 验 室

15、应 根 据 检 测 工 作 进 行相 应 的 生 物 安 全 等 级 备 案 。 4.3.2 化 学 危 险 性分 子 生 物 学 实 验 过 程 可 能 使 用 含 有 毒 性 的 或 致 突 变 的 化 学 物 质 （ 如 氯 仿 、 溴 化 乙 啶 和 苯 酚 ） ， 每 一种 化 学 品 的 使 用 应 遵 循 我 国 对 化 学 品 使 用 的 相 关 规 定 。4.3.3 物 理 危 险 性分 子 生 物 学 实 验 过 程 可 能 遇 到 具 有 潜 在 的 物 理 危 险 性 （ 如 电 泳 仪 、 紫 外 线 及 离 心 设 备 ） ， 应 遵 循 相应 仪 器 的 操 作

16、规 则 。5 试 剂 耗 材 的 采 购 和 储 存5.1 通 用 要 求5.1.1 应 制 定 并 执 行 检 测 试 剂 、 耗 材 的 选 择 、 购 买 、 接 收 和 储 存 的 程 序 。5.1.2 购 买 的 检 测 试 剂 、 耗 材 ， 验 收 合 格 后 方 可 使 用 并 保 留 验 收 记 录 。5.1.3 应 对 影 响 检 测 质 量 的 关 键 耗 材 、 试 剂 供 应 商 进 行 评 价 ， 保 存 评 价 记 录 和 供 应 商 名 录 。 5.2 试 剂 耗 材 评 估5.2.1 选 购 影 响 检 测 质 量 的 关 键 耗 材 、 试 剂 前 应 进

17、行 评 估 ， 产 品 质 量 应 满 足 实 验 室 检 测 要 求 。5.2.2 更 换 试 剂 和 耗 材 的 生 产 商 应 进 行 评 估 ， 产 品 质 量 应 满 足 实 验 室 检 测 要 求 。5.2.3 使 用 新 批 号 试 剂 前 ， 应 对 新 、 旧 批 号 质 量 进 行 比 对 。 可 采 用 平 行 检 测 同 一 样 本 或 质 控 品 的 方 式 ，新 批 号 质 量 应 满 足 实 验 室 检 测 要 求 。 WS/T 785 2021 3 5.2.4 影 响 检 测 质 量 的 关 键 耗 材 、 试 剂 应 确 认 合 格 ， 经 实 验 室 主 任

18、 或 者 授 权 人 审 批 后 才 投 入 使 用 。5.3 试 剂 的 来 源 、 制 备 及 储 存5.3.1 应 记 录 影 响 检 测 质 量 的 关 键 耗 材 和 试 剂 的 来 源 ， 包 括 制 造 商 、 供 应 商 、 购 买 日 期 、 购 买 人 、 试剂 批 号 等 ， 且 易 于 查 询 。5.3.2 所 有 检 测 试 剂 应 使 用 等 级 匹 配 的 化 学 试 剂 配 制 ， 保 证 检 测 试 剂 达 到 分 子 生 物 学 等 级 水 准 。5.3.3 应 按 照 实 验 室 标 准 操 作 规 程 进 行 试 剂 配 制 ， 并 进 行 记 录 。5

19、.3.4 所 有 使 用 的 试 剂 应 清 晰 标 记 名 称 、 浓 度 、 试 剂 特 性 、 无 菌 状 态 、 试 剂 保 存 条 件 、 配 制 人 、 配 制日 期 或 开 启 日 期 、 试 剂 有 效 期 ， 并 清 晰 标 示 试 剂 毒 性 。5.3.5 所 有 使 用 的 商 业 试 剂 的 储 存 标 准 应 与 制 造 商 提 供 的 说 明 书 相 一 致 。5.3.6 商 业 或 者 自 制 的 试 剂 、 水 、 溶 液 、 培 养 基 、 质 控 品 、 校 准 品 及 其 他 试 剂 ， 当 超 过 使 用 效 期 、 性质 改 变 或 质 量 下 降 时

20、 ， 不 应 使 用 。5.3.7 使 用 商 业 试 剂 盒 应 遵 循 制 造 商 的 说 明 书 。5.3.8 应 记 录 每 次 检 测 使 用 试 剂 的 批 号 或 者 货 号 。 6 样 本 的 采 集 和 处 理6.1 患 者 或 被 检 测 者 信 息6.1.1 患 者 或 被 检 测 者 的 送 检 单 信 息 内 容 应 包 括 姓 名 、 性 别 、 出 生 日 期 （ 年 龄 ） 、 采 样 日 期 、 样 本 类型 、 送 检 医 师 姓 名 、 临 床 相 关 资 料 或 实 验 室 检 查 资 料 ， 可 酌 情 调 整 内 容 。6.1.2 样 本 容 器 上

21、 应 标 注 唯 一 性 标 识 。6.1.3 患 者 或 被 检 测 者 信 息 表 、 样 本 、 验 收 记 录 应 归 档 保 存 ， 便 于 分 析 和 追 溯 。6.1.4 实 验 室 应 确 保 患 者 或 被 检 测 者 信 息 的 安 全 性 和 保 密 性 。6.1.5 患 者 或 被 检 测 者 的 样 本 被 用 于 科 研 项 目 或 商 业 项 目 时 ， 应 经 过 伦 理 审 查 和 知 情 同 意 ； 如 患 者 或被 检 测 者 样 本 仅 进 行 临 床 检 测 ， 则 无 需 填 写 知 情 同 意 书 。6.2 样 本 采 集6.2.1 样 本 采 集

22、 前 应 明 确 采 集 方 法 、 采 集 部 位 和 保 存 方 式 ， 准 备 好 采 集 器 械 。 采 集 样 本 类 型 可 为 外 周血 、 口 腔 拭 子 、 骨 髓 细 胞 、 唾 液 、 组 织 。 6.2.2 样 本 采 集 应 按 照 实 验 室 操 作 标 准 进 行 操 作 ， 并 进 行 记 录 。6.2.3 采 集 样 本 时 应 注 意 影 响 样 本 采 集 和 质 量 的 因 素 ， 外 周 血 推 荐 使 用 EDTA 等 抗 凝 剂 ， 不 宜 使 用 肝 素抗 凝 。6.2.4 采 集 的 样 本 应 具 有 唯 一 性 标 识 ， 并 与 送 检

23、单 一 一 对 应 ， 可 追 溯 患 者 姓 名 、 出 生 日 期 、 医 院 编 号或 者 实 验 室 编 号 、 样 本 采 集 日 期 和 采 集 时 间 。6.3 样 本 运 输6.3.1 样 本 可 以 常 温 或 普 通 冰 袋 运 输 ， 防 止 反 复 冻 融 和 污 染 。6.3.2 样 本 应 有 运 输 清 单 信 息 ， 包 括 样 本 编 号 、 采 集 时 间 、 采 集 实 验 室 、 采 集 人 、 样 本 数 量 、 患 者 信息 、 运 输 容 器 、 运 输 方 式 和 保 存 方 式 等 。6.4 样 本 接 收 和 验 收6.4.1 接 收 样 本

24、 时 ， 应 做 好 接 收 验 收 记 录 ， 包 括 样 本 来 源 、 类 型 、 运 输 方 法 、 运 输 容 器 、 实 验 室 接 收样 本 的 日 期 、 样 本 质 量 和 数 量 、 附 带 资 料 等 。6.4.2 当 样 本 信 息 不 足 、 样 本 处 理 或 运 输 不 当 、 量 不 能 满 足 检 测 、 抗 凝 方 式 不 当 ， 实 验 室 可 以 拒 收 样 本 并 做 好 相 应 记 录 ， 通 知 送 检 方 重 新 送 检 。6.4.3 验 收 通 过 的 样 本 应 按 实 验 要 求 进 行 编 号 并 存 储 样 本 信 息 。6.4.4 采

25、 集 后 的 样 本 可 于 4 暂 存 2 周 ， 超 出 2 周 宜 在 -20 以 下 冰 箱 保 存 。 样 本 应 避 免 反 复 冻 融 和 相互 污 染 ， 尽 早 提 取 核 酸 。6.5 样 本 基 因 组 DNA 提 取 、 检 测 和 保 存 WS/T 785 2021 4 6.5.1 样 本 基 因 组 DNA 提 取6.5.1.1 可 从 多 种 类 型 的 样 本 中 提 取 基 因 组 DNA， 提 取 方 法 应 已 获 得 广 泛 认 可 ， 并 经 实 验 室 验 证 。6.5.1.2 提 取 DNA 时 应 记 录 所 有 操 作 步 骤 及 试 剂 来

26、源 ， 操 作 步 骤 及 试 剂 来 源 的 任 何 变 动 或 实 验 过 程 中的 任 何 异 常 现 象 也 应 记 录 ， 操 作 人 应 签 字 并 注 明 实 验 日 期 。6.5.1.3 应 设 有 独 立 的 DNA 提 取 操 作 区 。 操 作 区 照 明 和 通 风 设 备 应 满 足 实 验 要 求 ， 关 键 设 备 配 置 无 中断 或 紧 急 电 源 ， 并 利 用 物 理 或 生 化 手 段 防 止 污 染 。 区 域 内 使 用 专 用 工 作 服 、 手 套 和 一 次 性 用 品 。6.5.1.4 DNA提 取 前 应 验 证 所 有 试 剂 质 量 以

27、 及 DNA 提 取 系 统 。 应 按 照 标 准 操 作 规 程 提 取 DNA， 操 作 手 册置 于 便 于 取 阅 的 地 方 。6.5.1.5 应 保 留 部 分 原 始 样 本 ， 不 应 全 部 用 来 提 取 DNA， 以 便 后 续 追 溯 和 使 用 。6.5.1.6 DNA 提 取 完 成 后 应 填 写 提 取 记 录 ， 包 括 样 本 编 号 、 提 取 时 间 、 提 取 操 作 人 、 提 取 方 式 、 样 本浓 度 和 体 积 等 。6.5.2 DNA 浓 度 的 测 定6.5.2.1 对 于 要 求 高 纯 度 核 酸 的 检 测 方 法 ， 应 对 获

28、 取 的 DNA 进 行 浓 度 和 纯 度 的 检 测 ， 可 使 用 分 光 光 度 计 法 和 电 泳 法 。6.5.2.2 分 光 光 度 计 对 DNA 浓 度 测 定 前 应 先 校 正 ， 并 设 立 合 适 的 对 照 。 DNA 样 本 被 检 测 时 ， 应 保 证 其全 部 溶 解 且 浓 度 均 匀 。 核 酸 最 大 吸 收 波 长 在 260 nm， 1.0 的 光 密 度 值 相 当 于 双 链 DNA 含 量 为 50 g/mL；蛋 白 质 最 大 吸 收 波 长 在 280 nm 处 ， 因 此 测 定 A260/A280 比 值 ， 可 判 断 样 本 中

29、蛋 白 质 和 RNA 污 染 的 情 况 。比 值 在 1.8 2.0 之 间 ， 说 明 DNA 纯 度 高 ； 比 值 小 于 1.6， 说 明 样 本 中 蛋 白 质 残 留 较 多 ； 如 果 比 值 大 于2.0， 可 能 样 本 有 RNA 污 染 ， 建 议 重 新 抽 提 或 纯 化 。6.5.2.3 电 泳 法 常 用 来 判 断 DNA 的 完 整 性 和 RNA 污 染 情 况 。6.5.2.4 DNA 浓 度 、 纯 度 和 完 整 性 应 符 合 实 验 室 使 用 试 剂 的 要 求 。 若 不 符 合 后 续 检 测 的 要 求 ， 应 重 新抽 提 。6.5.

30、3 基 因 组 DNA 的 保 存基 因 组 DNA可 于 4 暂 存 2周 ， 超 出 2周 宜 在 -20 以 下 冰 箱 保 存 。 -20 保 存 超 过 1年 后 再 使 用 ， 应 先进 行 DNA质 量 评 估 ， 满 足 实 验 要 求 方 可 使 用 。7 HLA 基 因 分 型 检 测 方 法 7.1 聚 合 酶 链 反 应 -序 列 特 异 性 引 物 （ polymerase chain reaction-sequence specific primer， PCR-SSP）方 法7.1.1 基 本 原 理根 据 HLA基 因 序 列 的 多 态 性 ， 设 计 一 系

31、列 等 位 基 因 特 异 性 引 物 ， 通 过 特 定 的 PCR反 应 体 系 扩 增 各 等 位基 因 的 特 异 性 DNA片 段 ， 产 生 相 对 应 的 特 异 性 扩 增 产 物 条 带 ， 然 后 通 过 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 PCR扩 增 产 物 ，根 据 是 否 得 到 PCR产 物 以 及 产 物 的 片 段 大 小 进 行 HLA基 因 分 型 。 PCR-SSP的 3 端 引 物 和 靶 DNA特 异 性 结 合后 ， Taq酶 使 配 对 引 物 的 3 端 延 伸 ， 但 非 配 对 的 不 延 伸 ， 所 以 只 有 当 靶 DNA和 上 下

32、游 引 物 全 部 互 补 时 才能 有 效 扩 增 。 PCR-SSP引 物 体 系 的 特 异 性 是 通 过 上 下 游 引 物 特 异 性 之 间 的 交 叉 来 实 现 的 。7.1.2 检 测 设 备 及 引 物 设 计7.1.2.1 必 需 的 设 备 （ 包 括 但 不 限 于 ） ： 96 孔 PCR 板 、 专 用 贴 膜 ； 单 通 道 移 液 器 、 多 通 道 移 液 器 ； 96孔 或 384 孔 模 块 PCR 仪 ； 电 泳 系 统 及 核 酸 片 段 分 析 系 统 。7.1.2.2 基 于 PCR-SSP 法 的 HLA 基 因 分 型 技 术 ， 关 键

33、是 准 确 设 计 特 异 性 的 引 物 。 该 引 物 序 列 应 与 所 检测 的 HLA 等 位 基 因 序 列 相 对 应 ， 宜 使 用 商 业 试 剂 盒 。 7.1.2.3 PCR引 物 和 引 物 混 合 物 宜 分 装 保 存 。7.1.3 结 果 分 析 及 问 题 解 决 方 法7.1.3.1 总 述 WS/T 785 2021 5 每 个 PCR-SSP反 应 ， 如 果 有 内 对 照 扩 增 ， 则 该 反 应 有 效 。 如 果 一 个 反 应 既 没 有 内 对 照 又 没 有 特 异 基因 扩 增 条 带 ， 则 该 反 应 失 败 。 如 果 一 个 反

34、应 没 有 内 对 照 扩 增 ， 即 使 这 个 等 位 基 因 在 该 反 应 里 被 扩 增 了 ，也 被 视 为 检 测 失 败 。 等 位 基 因 的 型 别 通 过 阳 性 和 阴 性 反 应 的 格 局 来 判 别 。 单 孔 反 应 失 败 时 ， 应 重 新 进 行PCR扩 增 反 应 。7.1.3.2 常 见 问 题 的 可 能 原 因 及 解 决 方 法7.1.3.2.1 无 等 位 基 因 和 无 内 对 照 片 段 扩 增a) 检 测 试 剂 或 PCR 仪 的 问 题 ， 可 用 确 认 的 DNA 样 本 对 检 测 试 剂 和 PCR 仪 进 行 验 证 ；b)

35、 DNA 的 质 量 不 符 合 要 求 ， 当 DNA 浓 度 太 低 ， 可 以 适 当 增 加 DNA 模 板 量 ， 或 增 加 Taq 酶 量 或 两 者同 时 增 加 ；c) Taq 酶 可 能 失 效 ， 更 换 Taq 酶 。 实 验 室 应 正 确 存 储 和 使 用 Taq 酶 。7.1.3.2.2 整 体 扩 增 条 带 显 色 强 度 弱a) PCR 仪 的 问 题 ， 用 确 认 的 DNA 样 本 检 测 PCR 仪 ； b) DNA 的 质 量 不 符 合 要 求 ， 参 照 7.1.3.2.1 b)；c) Taq 酶 质 量 低 或 过 度 稀 释 。 应 提

36、高 Taq 酶 浓 度 ， 确 保 Taq 酶 正 确 保 存 和 使 用 。 每 个 实 验 应 选 择合 适 的 Taq 酶 浓 度 ；d) PCR 相 关 试 剂 未 正 确 保 存 、 配 制 及 使 用 ， 应 确 保 每 一 步 骤 严 格 按 照 标 准 操 作 规 程 进 行 ， 必 要 时更 换 新 的 试 剂 。7.1.3.2.3 单 一 位 点 出 现 多 个 等 位 基 因 扩 增 条 带a) 样 本 DNA 受 到 污 染 ， 这 种 污 染 会 在 多 个 反 应 孔 中 产 生 额 外 条 带 ， 可 能 出 现 两 种 样 本 的 反 应 格局 ， 应 重 新

37、提 取 样 本 DNA；b) PCR 产 物 污 染 ， 这 种 污 染 会 在 单 个 或 少 数 检 测 位 点 产 生 额 外 条 带 ， 应 使 用 新 的 试 剂 进 行 重 新 扩增 ；c) 可 能 是 新 的 等 位 基 因 ， 应 使 用 其 他 分 子 生 物 学 方 法 进 行 确 认 。7.1.3.2.4 多 个 或 所 有 位 点 出 现 多 个 等 位 基 因 扩 增 条 带a) 样 本 DNA 受 到 污 染 ， 这 种 污 染 大 多 数 会 在 多 个 或 所 有 基 因 位 点 的 反 应 孔 中 产 生 额 外 条 带 ， 可 能 出 现 两 种 样 本 的

38、 反 应 格 局 ， 应 重 新 提 取 样 本 DNA；b) PCR 仪 加 热 系 统 错 误 ， 如 果 PCR 程 序 被 中 断 或 重 启 （ 尤 其 是 在 早 期 阶 段 ） ， 可 以 看 到 多 条 条 带 ，应 对 PCR 仪 进 行 检 修 和 校 准 ；c) 样 本 或 PCR 反 应 液 受 到 污 染 ， 应 重 新 采 集 样 本 或 配 制 新 的 试 剂 进 行 扩 增 检 测 。7.1.3.2.5 一 个 基 因 位 点 上 无 特 异 性 扩 增 条 带a) PCR 反 应 液 配 制 错 误 ， 应 确 保 所 有 的 PCR 反 应 组 份 在 使

39、用 前 经 过 验 证 ；b) 如 果 dNTP（ 脱 氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸 ） 与 MgCl2的 比 例 不 合 适 ， 可 影 响 一 个 或 更 多 基 因 位 点 的 扩 增 ，表 现 出 在 一 个 特 殊 的 位 点 没 有 等 位 基 因 ， 可 调 整 dNTP 与 MgCl 2比 例 进 行 再 次 测 试 ；c) 如 果 某 些 等 位 基 因 有 较 高 的 G/C 含 量 ， 可 因 Taq 酶 选 择 不 当 导 致 难 以 扩 增 。 应 更 换 合 适 的 Taq酶 。7.1.3.2.6 有 等 位 基 因 扩 增 条 带 但 无 内 对 照 条 带a)

40、 DNA 降 解 ， 使 分 子 量 大 的 扩 增 条 带 难 以 产 生 ， 如 内 对 照 无 扩 增 条 带 ， 应 重 新 提 取 样 本 DNA；b) PCR 延 伸 时 间 不 足 ， 应 增 加 PCR 反 应 延 伸 时 间 ；c) PCR 仪 故 障 ， 应 重 新 校 准 PCR 仪 ；d) 内 对 照 扩 增 引 物 浓 度 过 低 ， 应 提 高 引 物 浓 度 。7.1.3.2.7 有 内 对 照 扩 增 条 带 但 无 等 位 基 因 条 带a) 镁 离 子 浓 度 过 高 ， 应 重 新 配 制 PCR 扩 增 试 剂 ；b) PCR 仪 盖 压 力 不 够 ，

41、 应 确 保 PCR 仪 盖 和 PCR 管 /板 之 间 的 压 力 匹 配 。 WS/T 785 2021 6 7.1.3.2.8 部 分 分 型 结 果 清 晰 ， 部 分 分 型 结 果 失 败a) PCR 仪 加 热 系 统 故 障 ， 应 确 保 PCR 仪 加 热 模 块 的 一 致 性 ；b) PCR 管 /板 和 PCR 仪 加 热 模 块 不 匹 配 ， 应 确 保 PCR 管 /板 的 底 部 直 接 接 触 PCR 仪 加 热 模 块 ；c) PCR 仪 盖 压 力 不 均 匀 ， 应 确 保 PCR 仪 盖 和 PCR 管 /板 之 间 的 压 力 匹 配 ；d) 凝

42、 胶 电 泳 时 核 酸 染 料 没 有 混 合 均 匀 或 浓 度 不 足 ， 应 重 新 配 制 凝 胶 或 核 酸 染 料 溶 液 。7.1.4 检 测 方 法 的 局 限 性基 于 已 知 序 列 信 息 的 分 型 方 法 可 能 检 测 不 到 新 的 等 位 基 因 ， 或 者 无 法 与 已 知 等 位 基 因 相 区 别 ， 为 避免 漏 检 新 的 等 位 基 因 ， 当 使 用 PCR-SSP方 法 时 ,可 采 用 多 种 引 物 ， 以 提 高 检 测 到 新 等 位 基 因 的 可 能 性 。7.2 聚 合 酶 链 反 应 -序 列 特 异 性 寡 核 苷 酸 杂

43、交 （ polymerase chain reaction-sequence specificoligonucleotide， PCR-SSO） 方 法7.2.1 基 本 原 理PCR-SSO方 法 首 先 是 对 HLA的 多 态 性 区 域 进 行 扩 增 ， 然 后 根 据 碱 基 配 对 原 则 使 用 特 异 性 探 针 进 行 杂 交 ， 根 据 杂 交 信 号 判 断 结 果 。 基 于 PCR-SSO技 术 的 HLA分 型 方 法 主 要 包 括 正 相 SSO方 法 和 反 相 SSO方 法 两 种 。PCR-SSO技 术 具 有 灵 敏 度 高 、 特 异 性 强 、 加

44、 样 量 少 的 特 点 。2000年 后 基 于 流 式 荧 光 检 测 仪 Luminex平 台 的 PCR-SSO基 因 分 型 检 测 系 统 开 发 成 功 ， 它 利 用 传 统PCR-SSO的 原 理 ， 首 先 对 样 本 的 HLA多 态 性 区 域 进 行 扩 增 ， 扩 增 产 物 经 解 链 后 与 包 被 在 微 珠 上 的 特 异 性 探针 杂 交 结 合 ， 通 过 Luminex流 式 荧 光 检 测 仪 检 测 ， 确 定 HLA分 型 结 果 。 该 系 统 是 整 合 了 荧 光 编 码 微 珠 、 激光 检 测 、 应 用 流 体 力 学 、 高 速 数

45、 字 信 号 和 计 算 机 运 算 法 等 多 项 技 术 的 高 通 量 检 测 平 台 。 7.2主 要 针 对Luminex平 台 的 PCR-SSO HLA基 因 分 型 检 测 技 术 进 行 说 明 和 要 求 。7.2.2 必 需 的 设 备 与 耗 材 （ 包 括 但 不 限 于 ）96孔 PCR板 、 96孔 杂 交 板 、 96孔 读 取 板 、 专 用 贴 膜 ， 单 通 道 移 液 器 、 多 道 移 液 器 ， 96孔 PCR仪 、 Luminex分 析 仪 ， 平 板 离 心 机 ， 电 泳 系 统 及 成 像 系 统 。7.2.3 PCR 引 物 和 杂 交 探

46、 针 的 设 计7.2.3.1 PCR扩 增 引 物 一 般 至 少 针 对 HLA 类 基 因 （ HLA-A, HLA-B, HLA-C） 的 2 号 外 显 子 和 3 号 外显 子 进 行 扩 增 ， 至 少 针 对 HLA 类 基 因 （ HLA-DRB1， HLA-DQB1） 的 2号 外 显 子 进 行 扩 增 。 7.2.3.2 基 于 PCR-SSO 法 的 HLA 基 因 分 型 技 术 的 关 键 是 准 确 地 设 计 特 异 性 杂 交 探 针 ， 该 探 针 序 列 应 与所 检 测 的 HLA 等 位 基 因 序 列 相 匹 配 。7.2.3.3 PCR 引 物

47、应 于 -20 保 存 ,包 被 探 针 的 微 珠 应 避 免 反 复 冻 融 、 剧 烈 震 荡 ， 按 厂 家 说 明 书 要 求 条件 保 存 。7.2.4 结 果 分 析 及 问 题 解 决 方 法7.2.4.1 总 述对 于 每 个 PCR-SSO反 应 ， 如 果 内 对 照 杂 交 信 号 达 到 阈 值 ， 可 认 为 反 应 有 效 ； 如 内 对 照 和 特 异 等 位 基因 杂 交 信 号 均 未 达 到 阈 值 ， 可 认 为 反 应 失 败 ； 如 内 对 照 杂 交 信 号 未 达 到 阈 值 ， 即 使 特 异 等 位 基 因 杂 交 信号 达 到 阈 值 ，

48、也 认 为 反 应 失 败 。7.2.4.2 常 见 问 题 可 能 原 因 及 解 决 方 法7.2.4.2.1 扩 增 反 应 失 败 （ 电 泳 显 示 无 扩 增 条 带 ）a) 检 测 试 剂 或 PCR 仪 的 问 题 ， 用 确 认 的 DNA 样 本 对 检 测 试 剂 和 PCR 仪 进 行 验 证 ； b) DNA 的 质 量 不 符 合 要 求 ， DNA 浓 度 太 低 ， 可 以 适 当 增 加 DNA 模 板 量 ， 或 增 加 Taq 酶 量 或 两 者同 时 增 加 ， 如 果 凝 胶 成 像 显 示 DNA 条 带 正 常 ， 可 能 是 DNA 纯 度 差

49、的 原 因 ， 需 要 重 新 提 取 DNA。7.2.4.2.2 微 珠 读 取 数 量 未 达 到 阈 值a) Luminex 仪 器 进 样 针 堵 塞 ， 应 对 仪 器 进 行 检 修 ；b) 微 珠 混 合 不 均 匀 ， 应 确 保 每 一 步 骤 严 格 按 照 标 准 操 作 规 程 进 行 ； WS/T 785 2021 7 c) 微 珠 的 保 存 条 件 不 正 确 ， 应 按 厂 家 说 明 书 要 求 进 行 保 存 。7.2.4.2.3 杂 交 荧 光 信 号 出 现 假 阴 性 或 未 达 到 阈 值a) PCR 反 应 扩 增 失 败 或 扩 增 反 应 弱 ， 应 参 照 7.2.4.2.1 的 解 释 ；b) 杂 交 试 剂 和 Luminex 仪 器 的 问 题 ， 用 确 认 的 DNA 样 本 对 检 测 试 剂 和 Luminex 仪 器 进 行 验 证 ；c) 杂 交 试 剂 的 保 存 、 配 制 以 及 杂 交 后 洗 涤 条 件 不 当 ， 应 确 保 每 一 步 骤 严 格 按 照 标 准 操 作 规 程 进行 。7.2.4.2.4 杂 交 荧 光 信 号 出 现 假 阳 性a) DNA 纯 度 和 浓 度 没 有 达 到 要 求 ， 应 参 照 7.2.4.2.1 b)的 解 释 ；b) PCR 扩 增 反 应 中 T