SN T 5384-2021 辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS65.020.01 CCSB16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T53842021 辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofChilliveinalmottlevirus 2021-06-18发布2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署发布 前 言 本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、福建农林大学、

2、中国检验检疫科学研究院、中国农业科 学院生物技术研究所、中华人民共和国厦门海关。 本文件主要起草人:蔡伟、高芳銮、邓真、陈细红、张永江、李为民、李敏、廖富荣、林春滢、杨宏凯。 SN/T53842021 辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了辣椒脉斑驳病毒检测的程序和方法。 本文件适用于进出境寄主植物及产品中辣椒脉斑驳病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法

3、 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 辣椒脉斑驳病毒基本信息 中文名:辣椒脉斑驳病毒 学名:ChilliVeinalMottlevirus;ChiVMV。 分类地位:马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员。 辣椒脉斑驳病毒的寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附 录A。 5 原理 辣椒脉斑驳病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。 6 仪器设备、用具及试剂 6.1 仪器设备 高速冷冻离心机、电子天平(1/1000g)、PCR仪、

4、电泳仪、水平电泳槽、-20低温冰箱和-80 超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、酶 标仪等。 6.2 用具 各种量程的可调移液器(1000L、200L、100L、20L、10L、2L)、PCR反应管、无RNase离 1 SN/T53842021 心管(1.5mL)、研钵、酶联板等。 6.3 试剂 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)试剂按照附录B执行、免疫层析试纸条试剂按照附录 C执行、RT-PCR试剂按照附录D执行。除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682 中相关规定。 7 检测与鉴定 7.1 抽样

5、检查 按照SN/T2122给出的方法进行抽样、取样,并检查植株是否有矮化、畸型,叶片花叶、斑驳等疑似 病毒危害症状。 7.2 样品制备 分别按照有症状和无症状进行样品制备。有症状植株每株单独编号并采集症状部位制样;无症状 植株,5株为一组编号并混合制样。称取0.5g1.0g待测样品按110(质量:体积,W/V)加入抽提缓 冲液,用研钵研磨成浆,4下10000g离心10min,上清即为样品提取液,用于DAS-ELISA、免疫层 析试纸条和RT-PCR检测;或称取0.1g待测样品提取核酸后用于RT-PCR检测。 7.3 DAS-ELISA 具体方法按附录B检测。 7.4 免疫层析试纸条 具体方法按

6、附录C检测。 7.5 RT-PCR 具体方法按附录D检测。 7.6 序列测定与比对 PCR产物纯化后直接测序或者克隆测序,利用NCBI网站上的BLAST软件把测序所得到的核苷 酸序列与已知ChiVMV序列进行比对。 8 结果判定 DAS-ELISA或免疫层析试纸条检测结果为阴性,且RT-PCR检测结果为阴性,则判定样品不携带 ChiVMV。 DAS-ELISA或免疫层析试纸条检测结果为阴性,但RT-PCR检测为阳性,则需进一步序列测定。 序列测定结果经比对分析为ChiVMV,则判定样品携带ChiVMV。 DAS-ELISA或免疫层析试纸条检测结果为阳性,则采用RT-PCR方法进行验证,若验证结

7、果为阳 性,则判定样品携带ChiVMV;若验证结果为阴性,则判定样品不携带ChiVMV。 9 结果记录与样品保存 9.1 结果记录 记录好各项实验数据,包括样品来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有经手人 2 SN/T53842021 和实验人员的签字。血清学DAS-ELISA检测结果保留吸光值的数据报告、免疫层析试纸条检测保留 试纸条检测图片、RT-PCR检测结果保留电泳照片、序列测定保留测序报告。 9.2 样品保存 经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-20或-80冰箱中,并作好登记和标记工作,以 备复核用。 3 SN/T53842021 附 录 A (资料性) 辣椒脉

8、斑驳病毒的背景资料 A.1 寄主范围 已报道的自然寄主为辣椒(CapsicumannuumL.)、烟草(NicotianatabacumL.)、番茄(Solanum lycopersicumL.)、茄子(SolanummelongenaL.)等作物。 A.2 病害症状 该病毒在不同寄主上引起的症状存在一定差异。ChiVMV侵染辣椒后引起的典型症状是叶脉出 现暗绿条纹,叶沿皱缩,叶片变小,结果前严重落花。此外,还可引起辣椒果实出现斑驳、畸形等症状。 见图A.1。 (引自http:/ippc.acfs.go.th/pest/G001/T006/VIRUS007) 图A.1 ChiVMV侵染引起的症

9、状 A.3 分布地区 马来西亚、韩国、泰国、印度、中国、日本、朝鲜、巴基斯坦、菲律宾、斯里兰卡、越南、坦桑尼亚和巴布 亚新几内亚等国家。 A.4 传播途径 主要通过蚜虫以非持久性方式传播,同时能通过机械接种传播。 A.5 粒体形态 病毒粒体呈弯曲线状,长约900nm,直径约14nm。见图A.2。 4 SN/T53842021 (引自Banerjeeetal.,2014) 图A.2 ChiVMV病毒粒体 A.6 病毒基因组 正义单链RNA病毒,基因组全长约9.7kb。 5 SN/T53842021 附 录 B (规范性) 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) B.1 试剂 B.1.1

10、 包被抗体 特异性的辣椒脉斑驳病毒抗体。 B.1.2 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的辣椒脉斑驳病毒抗体。 B.1.3 底物 对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。 B.1.4 1PBST缓冲液(pH7.4) 氯化钠(NaCl) 8.0g 磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g 磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.15g 氯化钾(KCl)0.2g 吐温-200.5mL 溶于900mL灭菌双蒸水中,并定容至1000mL,4储存。 B.1.5 抽提缓冲液(pH7.4) 亚硫酸钠(Na2SO3)1.3g 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW2400040000)20.0g 溶于900mL的1PBST中,并用1PBST定容至1

11、000mL,4储存。 B.1.6 包被缓冲液(pH9.6) 碳酸钠(Na2CO3)1.59g 碳酸氢钠(NaHCO3)2.93g 溶于900mL灭菌双蒸水中,并定容至1000mL,4储存。 B.1.7 酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4) 牛血清白蛋白(BSA)2.0g 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW2400040000)20.0g 溶于900mL1PBST中,并用1PBST定容至1000mL,4储存。 B.1.8 底物缓冲液(pH9.8) 二乙醇胺97mL 氯化镁(MgCl2)0.1g 6 SN/T53842021 溶于800mL灭菌双蒸水中,用浓盐酸(HCl)调pH至9.8,定容至1000mL

12、,4储存。 B.2 程序 B.2.1 包被抗体 用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加入酶联板的孔中,100L/孔,加盖,37孵育2h或4冰箱 孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,PBST洗涤4次6次,每次1min。 B.2.2 加样 加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照和空白对照,并且至少一个重复,100L/孔,加盖, 37孵育2h或4冰箱孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,PBST洗涤4次6次,每次1min。阴性对 照为健康的植物组织(其种类和材料应尽量与检测样品一致),阳性对照为感染ChiVMV的植物组织, 空白对照为样品抽提缓冲液。 B.2.3 加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至

13、工作浓度,并加入到酶联板中,100L/孔,加盖, 37孵育2h,倒去酶联板孔中溶液,PBST洗涤4次6次,每次1min。 B.2.4 加底物 将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),按100L/孔,加入到酶联 板中,室温避光孵育。 B.2.5 读数 在不同的时间如30min、60min或更长时间,阳性对照孔明显显色后,酶标仪在405nm处读 OD值。 B.3 结果判定 在满足阴性对照孔的OD405值510、同一 样品的重复性基本一致(数值差别2,判为阳 性;样品OD405值/阴性对照OD405值在阈值附近,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验 证;样品OD

14、405值/阴性对照OD405值2,判为阴性。 7 SN/T53842021 附 录 C (规范性) 免疫层析试纸条检测 C.1 试剂 样品抽提缓冲液配制方法按照B.1.5执行。 C.2 试纸条保存 试纸条应在28冰箱内密封干燥保存。 C.3 检测步骤 C.3.1 样品准备 待测样品按7.2步骤制备,取300L样品液至1.5mL的离心管中。 C.3.2 样品检测 取出试纸条恢复至室温。将试纸条T线一端垂直插入到样品液中,样品液高度不要超过试纸条上 的MAX线。测试观察的时间以3min6min为宜。 注:对于病毒浓度低的样品,测试观察时间可适当延长至10min。 C.4 结果判定 质控C线显红色,

15、测试T线显红色,检测结果为阳性。 质控C线显红色,测试T线未显色,检测结果为阴性。 C.5 试纸条是否有效的判断方法 用阳性对照进行测试,测试T线显红色,质控C线显红色,说明整个系统工作正常。 用阳性对照进行测试,测试T线显红色,质控C线未显色,说明羊抗兔失效。 用阳性对照进行测试,测试T线未显色,质控C线显红色,说明测试T线的特异性抗体失效。 用阳性对照进行测试,若测试T线未显色,质控C线也未显色,说明整个测试纸条失效。 8 SN/T53842021 附 录 D (规范性) RT-PCR检测方法 D.1 试剂 D.1.1 TrizoL裂解液 D.1.2 5TBE缓冲液 Tris碱 54.0g

16、 硼酸(H3BO3)27.5g 0.5mol/LEDTA(pH8.0)20.0mL 补充蒸馏水至1000mL。用时加蒸馏水稀释至0.5TBE。 D.1.3 6加样缓冲液 0.25%溴酚蓝。 40%(W/V)蔗糖水溶液。 D.1.4 引物序列 根据已报道的ChiVMV基因组CP基因保守区域设计1对用于特异性扩增的引物,目的条带大小 为337bp。 正向引物ChiVMV-CP1:5-ACACCTTCTTGATTATGCTCC-3 反向引物ChiVMV-CP2:5-ATAAGGCTTCTCAGAATTGCG-3 D.2 RT-PCR检测 D.2.1 总RNA提取 取0.1g样品组织置于研钵中,加入液

17、氮充分研磨至粉末状后迅速移入1.5mL离心管,再加入 1mLTrizoL试剂(或取样品提取液100L置于1.5mL离心管中,再加入1mLTrizoL试剂),剧烈振 荡摇匀3min;4下12000g离心10min,取上清;加入三氯甲烷300L,剧烈振荡15s,室温静置 5min,4下12000g离心15min,取上层水相;加入等体积的异丙醇,颠倒混匀后室温下静置15min, 4下12000g离心10min,弃上清;加入1mL75%的乙醇洗涤沉淀2次,每次4下7500g离心 3min,弃上清;RNA沉淀干燥后,用20L40L经DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的ddH2O溶解, -80保存备用。 注:

18、总RNA的提取也可以采用商品化试剂盒。 D.2.2 cDNA合成 在PCR管中加入3L总RNA,1L随机引物(100mol/L)或1L反向引物ChiVMV-CP2, ddH2O7L,70水浴10min,迅速冰浴5min,再加入下列试剂:5RT缓冲液5L、dNTPs (10mmol/L)2L、M-MLVRT(200U/L)1L、RNasin(40U/L)1L。42水浴60min,70水 浴10min,自然冷却至室温,-20保存备用。 注:cDNA合成也可以采用商品化试剂盒。 9 SN/T53842021 D.2.3 PCR扩增 PCR反应体系见表D.1,每个反应设置2个重复。检测时以含有病毒目标

19、片段的质粒或含病毒材 料作为阳性对照,以不含病毒的健康植物组织作阴性对照,同时以水代替模板作为空白对照。 PCR反应条件:94预变性3min,然后94变性30s、53退火45s、72延伸1min,35个循 环,最后一个循环结束后72继续延伸10min。预期扩增条带大小为337bp。 表D.1 PCR反应体系 cDNA2.0L ChiVMV-CP1(10mol/L)1.0L ChiVMV-CP2(10mol/L)1.0L 2TaqPCRmix12.5L ddH2O8.5L 总体积25.0L 注:PCR扩增也可以采用商品化试剂盒。 D.2.4 琼脂糖凝胶电泳 制备1.5%的琼脂糖凝胶,对PCR产物

20、进行电泳,电压3-5V/cm,缓冲液0.5TBE。电泳结束 后,在溴化乙锭(EB,浓度为0.5g/mL)溶液染色10min后,再在凝胶成像分析系统中观察是否扩增出 预期的特异性DNA电泳带,拍照并做记录。 注:染色也可以采用其他染料。 D.2.5 结果判断 如果阴性对照和空白对照无特异性扩增、阳性对照扩增出大小约337bp的目的条带,待测样品扩 增出与阳性对照一致的目的条带,则判定为阳性。 如果阴性对照和空白对照无特异性扩增、阳性对照扩增出大小约337bp的目的条带,待测样品未 扩增出与阳性对照一致的目的条带,则判定为阴性。 01 SN/T53842021 参 考 文 献 1 Banerjee

21、A,DuttaR,RoyS,etal.FirstreportofChilliveinalmottlevirusinNagachilli (Capsicumchinense)inMeghalaya,India.Virusdisease,2014,25(1):42-143. 2 DingM,YangC,ZhangL,etal.OccurrenceofChilliveinalmottlevirusinNicotiana tabacuminYunnan,China.PlantDisease,2011,95(3):357. 3 RaviKS,JosephJ,NagarajuN,etal.Characte

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