SN T 5386-2021 葡萄灰皮诺病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS65.020.01 CCSB16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T53862021 葡萄灰皮诺病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Grapevine Pinot gris virus 2021-06-18发布2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署发布 前 言 本文件按照GB / T 1.1 2020 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国北京海关、北京爱普拜生物技术有限公司、中国检验检疫科学研 究院。 本文件主要起草

2、人:邓丛良、赵晓丽、向军、郑祖亮、刘兴亮、郑春生、吕玉峰。 SN/T53862021 葡萄灰皮诺病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了葡萄灰皮诺病毒的检疫鉴定方法。 本文件适用于可能带有葡萄灰皮诺病毒的葡萄苗木、接穗及其产品的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 微滴式数字PCR droplet digi

3、tal PCR 一种核酸单分子扩增技术,基于扩增前将混匀的PCR反应液被微滴发生器分成数万个单独的微反 应,核酸分子分布在不同的微反应中,独立进行单分子PCR扩增,降低了可能存在的竞争,待荧光PCR 反应结束后,逐一检查每个微滴是否有扩增发生,就可以精确测得待测DNA或RNA模板的分子数。 注: 不同于常规PCR和实时荧光PCR技术,该技术不需要制作标准曲线,也与待测分子PCR扩增效率无关,可以 直接测出样品中待测核酸模板的绝对数目,实现了DNA或RNA的绝对定量。 4 葡萄灰皮诺病毒基本信息 学名:Grapevine Pinot gris virus。 缩写: GPGV 。 分类地位:线形病

4、毒科( Betaflexiviridae ),纤毛病毒属(Trichovirus)。 传播途径:主要通过嫁接传播和机械传播。 葡萄灰皮诺病毒的其他信息参见附录A 。 5 方法原理 根据该病毒基因组特异性进行普通RT-PCR 、实时荧光RT-PCR和数字RT-PCR检测,通过电泳 条带大小、扩增曲线、产生微滴的变化和基因组序列进行结果判定。 1 SN/T53862021 6 仪器设备和试剂 6.1 仪器设备和用具 电子天平(感量0.001 g )、普通天平(感量0.1 g )、高速冷冻离心机、超低温冰箱( -80 )、凝胶成 像系统、 PCR仪、实时荧光PCR仪、数字PCR检测系统(微滴发生器、

5、封膜仪、普通PCR仪和微滴荧光 检测器)、核酸定量仪、可调移液器 ( 2.5 L , 10 L , 20 L , 200 L , 1 000 L )、无RNA酶吸头( 10 L , 20 L , 200 L , 1 000 L )、无RNA酶离心管、 PCR反应管( 200 L )、实时荧光96孔反应板、数字PCR 微反应体系生成联排管、 96孔荧光定量PCR反应板和封膜。 6.2 试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB / T 6682中相关规定。 普通RT-PCR检测试剂应符合附录B要求;实时荧光RT-PCR检测试剂应符合附录C要求;数字 RT-PCR检测试剂应符合附录

6、D要求。 7 检疫鉴定 7.1 检测样品的制备 苗木及接穗:有症状(节间缩短,叶片出现变色、卷叶和坏死症状)的苗木及接穗单独编号,每株采集 症状嫩叶片5 g用于后续检测;无症状的植株每10株分为1组编号,混合采集植株嫩叶10 g用于后续 检测。 植物产品(果实):有坏死症状的葡萄果粒单独采样用于后续检测,无症状的葡萄果粒每5穗分为 1组编号,每穗取4果粒,总计取20用于后续检测。 7.2 普通RT-PCR方法 提取样品总RNA ,设置阳性对照、阴性对照和空白对照,进行普通RT-PCR检测,具体操作步骤按 照附录B执行。 7.3 实时荧光RT-PCR方法 提取样品总RNA ,设置阳性对照、阴性对

7、照和空白对照,进行实时荧光RT-PCR检测,具体操作步 骤按照附录C执行。 7.4 数字RT-PCR方法 提取样品总RNA ,设置阳性对照、阴性对照和空白对照,进行数字荧光RT-PCR检测,具体操作步 骤按照附录D执行。 8 结果判定 同时符合普通RT-PCR检测和实时荧光RT-PCR检测结果为阳性,判定待检测样品携带葡萄灰皮 诺病毒。 同时符合普通RT-PCR检测和数字荧光RT-PCR检测结果为阳性,判定待检测样品携带葡萄灰皮 诺病毒。 2 SN/T53862021 当普通RT-PCR检测结果为阳性,则进行序列测定,测定序列经对比分析为葡萄灰皮诺病毒的,判 定待检测样品携带葡萄灰皮诺病毒。

8、9 样品保存与结果记录 9.1 样品保存 检测结果判定为阳性的样品应妥善保存于-80 冰箱中,并做好登记和标记,以备复核用。 9.2 结果记录 完整的实验记录要包括:样品的来源、种类、采集时间、实验检测时间、地点、方法和结果,并有实验 人员的签字;普通RT-PCR检测结果保存电泳图片,测序保留序列对比结果;实时荧光RT-PCR检测结 果保存荧光曲线图及Ct值;数字RT-PCR检测结果保存微滴生成图。 3 SN/T53862021 附 录 A (资料性) 葡萄灰皮诺病毒相关资料 A.1 寄主范围 自然条件下侵染葡萄(Vitis vinifera)。 A.2 危害症状 寄主受GPGV侵染后,叶片出

9、现变色、卷叶和坏死症状,果实表面出现坏死斑点,如图A.1所示。 说明: A 、 B 、 C 、 D 受侵染葡萄叶片症状( Annaisa Giam p etruzzi , 2012 ); E 、 F 受侵染葡萄果实症状( Cho IS , 2013 )。 图A.1 GPGV侵染葡萄植株和果实的症状 4 SN/T53862021 A.3 分布地区 韩国、意大利、斯洛文尼亚、西班牙、法国、加拿大、中国、捷克、斯洛伐克和希腊。 A.4 传播方式 主要通过嫁接传播和机械传播 A.5 基因组 病毒粒子为非常弯曲的长线形(见图A.2 ),长640 nm760 nm ,核酸为单分子线形正义ssRNA , 长

10、约7.5 kb ,核酸约占病毒粒子重量的5% 。 图A.2 病毒粒体形态(Giovanni P Martelli,2007) 5 SN/T53862021 附 录 B (规范性) 普通RT-PCR检测方法 B.1 主要试剂 B.1.1 RNA提取的主要试剂 Trizol裂解液、三氯甲烷、异丙醇、 75%乙醇。 B.1.2 50TAE Tris 242 g 冰醋酸 57.1 mL Na 2 EDTA 2H 2 O 37.2 g 加去离子水至1L ,使用时加水稀释至1TAE 。 B.2 实验步骤 B.2.1 RNA提取 取0.1 g叶片样品(果实取果皮),加液氮研磨成粉末状,将研磨物迅速移入1.5

11、 mL离心管中,加入 1 mL Trizol 试剂,颠倒混匀, 2 8 , 12 000 g ,离心10 min 。取上清, 15 30 ,放置5 min ;加 入0.2 mL三氯甲烷,用手剧烈振荡(勿涡旋振荡),约15 s 。 15 30 ,放置2 min3 min ; 2 8 , 12 000 g ,离心15 min 。小心吸取约为600 L的上层水相。加500 L异丙醇混合上清液, 15 30 ,放置10 min 。 2 8 , 12 000 g ,离心10 min 。去除上清液,沉淀中加入1 mL 75%乙 醇,洗涤; 2 8 , 12 000 g ,离心5 min 。去除上清液,沉淀

12、自然干燥后,将其溶于30 L50 L无 RNA酶的水中。同时以携带GPGV的葡萄叶片作为阳性对照提取其总RNA ,以健康的葡萄叶片作为 阴性对照提取其总RNA 。 RNA也可使用相应市售RNA提取试剂盒提取。 B.2.2 普通RT-PCR B.2.2.1 引物序列 根据已报道的GPGV基因组序列( I.S.CHO , 2013 ),合成一对扩增GPGV外壳蛋白基因的寡核苷 酸引物。 正向引物GPGV-FP : 5 -ATGTCGATTCGTCAGGAGCTG-3 反向引物GPGV-RP : 5 -CTACATACTAAATGCACTC-3 RT-PCR产物大小588 b p 。 B.2.2.2

13、 cDNA合成 反转录总体系为20 L 。在0.2 mL PCR管中加入提取的总RNA 2 L , dNTPs ( 10 mmol / L ) 2 L , DEPC-H 2 O 9.5 L ,引物GPGV-RP ( 20 mol / L ) 1 L , 5 M-MLV缓冲液 4 L ,反转录酶 ( 200 U / L ) 1 L , RNA酶抑制剂( 40 U / L ) 0.5 L 。 42 反应1 h 。逆转录产物置于-20 保存,应 尽快进行检测。也可采用RT-PCR一步法试剂盒,操作步骤按使用说明进行。 6 SN/T53862021 B.2.2.3 PCR反应 反应体系( 25 L )

14、:在0.2 mL PCR管中加入10PCR缓冲液2.5 L , dNTPs ( 2.5 mmol / L ) 0.5 L ,引物GPGV-FP ( 20 mol / L )和GPGV-RP ( 20 mol / L )各0.5 L ,Taq酶( 5 U / L ) 0.5 L ,模 板2 L , DEPC处理过的水补足到25 L 。每个样品设2个平行处理。 反应条件为: 94 5 min ; 94 20 s , 56 20 s , 72 30 s , 35个循环; 72 10 min 。 B.3 琼脂糖凝胶电泳检测 用1TAE配制1.5%的琼脂糖凝胶( 55 60 时加入溴化乙锭至终浓度为0.

15、5 g / mL ,也可 在电泳后进行染色)。取5 L的PCR产物与1 L的6上样缓冲液混合均匀,加入样品孔。恒压 5 V / cm电泳20 min30 min 。凝胶成像系统中观察电泳结果,拍照并记录结果。 B.4 结果判定 在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带、阳性对照产生约588 b p的预期大小条带情况下: 如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带,则为阳性;进行序列测定,用BlastN工具将得 到的序列在Genank中进行同源性比对,若测定核苷酸序列与葡萄灰皮诺病毒同源性最高达 到90%以上,判定待检测样品携带葡萄灰皮诺病毒。 如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带,则为阴

16、性。 7 SN/T53862021 附 录 C (规范性) 荧光RT-PCR检测方法 C.1 试剂 Premix Ex Taq ( Probe q PCR ), ROX p lus 。 C.2 实验步骤 C.2.1 RNA提取及cDNA合成 操作方法按照附录B 。 C.2.2 实时荧光PCR C.2.2.1 引物序列 根据已报道的GPGV基因组序列,设计一对扩增部分外壳蛋白基因的寡核苷酸引物和探针。 GPGV-F 5 -ACAATTTACCCCACCACAATGG-3 GPGV-R 5 -CAGCTAAGCTGTATTCCTTTACG-3 GPGV-P 5 -FAM-TTATGAATCTTTT

17、AATCCTTCCCTGCCGG-BHQ1-3 C.2.2.2 荧光PCR反应 反应体系( 25 L ):在0.2 mL PCR管中加入2Premix Ex Taq ( Probe q PCR ) 2.5 L ,引物 GPGV-F ( 20 mol / L )和GPGV-R ( 20 mol / L )各0.5 L ,探针GPGV-P ( 20 mol / L ) 0.25 L ,模板 2 L , DEPC处理过的水补足到25 L 。每个样品设2个平行处理。 反应条件为: 95 30 s ; 95 5 s , 60 30 s ,共40个循环。 C.3 结果判定 在空白对照及阴性对照无Ct值且无

18、扩增曲线、阳性对照Ct值30并出现典型扩增曲线的条 件下: 待测样品的Ct值40时,判定实时荧光RT-PCR结果为阴性; 待测样品的Ct值35时,判定实时荧光RT-PCR结果为阳性; 待测样品的Ct值小于40而大于35时,应重新进行测试;如果重新测试的Ct值40 ,则判定 实时荧光RT-PCR结果为阴性;如果重新测试的Ct值小于40而大于35 ,且分离曲线明显时, 则判定实时荧光RT-PCR结果为阳性。 8 SN/T53862021 附 录 D (规范性) 数字RT-PCR检测方法 D.1 试剂 按照不同的数字PCR反应平台的说明书选择适合的数字PCR反应试剂盒。 D.2 实验步骤 D.2.1

19、 RNA提取 操作方法按照附录B 。 D.2.2 数字RT-PCR检测 D.2.2.1 引物序列 根据已报道的GPGV基因组序列,设计一对扩增部分外壳蛋白基因的寡核苷酸引物和探针,探针 5 端含有FAM报告荧光染料, 3 端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。 GPGV-F1 5 -GGACAACATTGATAGGTAC-3 GPGV-R1 5 -CCCAACATCATTTCTGTG-3 GPGV-P1 5 -FAM-TACCTTCGGACAGTTCATCCATTGT-BHQ-3 D.2.2.2 数字RT-PCR反应 反应体系( 20 L ):采用一步法 RT-ddPCR Advanced

20、 Kit for Probes推荐的20 L体系, 4Su p ermix 5 L ,引物GPGV-F1 ( 20 mol / L )和GPGV-R1 ( 20 mol / L )各0.4 L ,探针GPGV-P1 ( 20 mol / L ) 0.2 L , RT Enz y me Mix ( 200 U / L ) 2 L ,模板2 L , DEPC处理过的水补足到20 L 。 每个样品设2个平行处理。将上述20 L样品反应体系加入到微滴生成卡中,再加入70 L微滴生成 油,混匀后转移到微滴生成仪上自动生成微滴;将产生的微滴仔细全部转移到96孔反应板PCR反应管 中;再将96孔反应板在封膜

21、仪上封膜,并置于普通PCR仪上进行PCR反应。 反应条件: 50 反转录10 min ; 95 预变性10 min ; 95 变性30 s , 60 退火1 min , 45个循环。 打开微滴荧光检测器应用软件,将完成PCR反应的96孔放入微滴读取仪中,设备自动检测每 PCR反应管中所有微滴的PCR反应情况,最后软件按照泊松分布原理给出待测RNA序列的拷贝数。 D.3 结果分析与判定 D.3.1 阈值的设定 根据数字PCR体系中阴性微滴簇荧光幅度的最高点为界来设定阈值线,阈值线需要对阴性和阳性 扩增结果进行明显的区分。 D.3.2 对照的设置 阴性对照:采用不含有GPGV的葡萄RNA作为数字P

22、CR反应模板。 空白对照:采用水作为数字PCR反应模板。 阳性对照:采用含有GPGV的葡萄RNA作为数字PCR反应模板。 9 SN/T53862021 D.3.3 质控标准 阳性对照为GPGV阳性基因有明显阳性微滴信号,扩增终点荧光信号大于或等于阈值。 阴性对照为GPGV阳性基因无阳性微滴信号,扩增终点荧光信号小于阈值。 空白对照为GPGV阳性基因无阳性微滴信号,扩增终点荧光信号小于阈值。 与以上实验结果不符,需要重复验证实验步骤。 D.3.4 结果判定 如果待测样品产生阳性微滴信号,则判定数字RT-PCR检测结果为阳性。 如果待测样品不产生阳性微滴信号,则判定数字RT-PCR检测结果为阴性。

23、 01 SN/T53862021 参 考 文 献 1 Giam p etruzzi A , Roumi V , Roberto R , et al.A new g ra p evine virus discovered b y dee p se- q uencin g of virus-and viroid-derived small RNAs in Cv Pinot g ris J .Virus Research , 2012 , 163 ( 1 ): 262-268. 2 Cho IS , Jun g SM , Cho JD , et al.First re p ort of Gra p

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