SN T 5385-2021 蓝莓焦枯病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS65.020 CCSB16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T53852021 蓝莓焦枯病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Blueberry scorch virus 2021-06-18发布2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署发布 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 蓝莓焦枯病毒检疫鉴定方法 SN / T 5385 2021 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号( 100023 ) 编辑部:( 010 ) 65194242-7531 网址 / book 中国标准出版社秦皇岛印刷

2、厂印刷 * 开本8801230 1 / 16 印张1 字数30千字 2021年 月第一版 2021年 月第一次印刷 印数 1 500 * 书号: 155175 673 定价16.00元 前 言 本文件按照GB / T 1.1 2020 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、福建省农业科学院果树研究所、中国农业科学院生物 技术研究所、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门海关、福建农林大学。 本文件主

3、要起草人:沈建国、谢丽雪、陈细红、李韬、李为民、张永江、廖富荣、高芳銮、陈寿铃。 SN/T53852021 蓝莓焦枯病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了蓝莓焦枯病毒的检疫鉴定方法。 本文件适用于可能携带蓝莓焦枯病毒的蓝莓繁殖材料的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN / T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 术语和定义 本文件没有需要界定的

4、术语和定义。 4 蓝莓焦枯病毒基本信息 中文名:蓝莓焦枯病毒。 学名:Blueberry scorch virus,缩写: BlScV 。 分类地位:乙型线状病毒科( Betaflexiviridae )、香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)成员。 蓝莓焦枯病毒的寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附 录A 。 5 原理 蓝莓焦枯病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。 6 仪器设备、用具及试剂 6.1 仪器设备 高速冷冻离心机、电子天平、酶标仪、 PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、水平电泳 槽、常规冰箱、超低温冰箱、恒

5、温水浴锅、高压灭菌锅、研磨仪等。 6.2 用具 各种量程的可调移液器( 1 000 L 、 200 L 、 100 L 、 20 L 、 10 L 、 2 L )、 PCR反应管、无RNase离 心管( 1.5 mL )、研钵、酶联板等。 1 SN/T53852021 6.3 试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB / T 6682中相关规定。双抗体夹心酶联 免疫吸附测定( DAS-ELISA )试剂应符合附录B的规定、免疫层析试纸条试剂应符合附录C的规定、巢 式RT-PCR试剂应符合附录D的规定、实时荧光RT-PCR试剂应符合附录E的规定。 7 检测与鉴定 7.1 抽样检

6、查 按照SN / T 2122给出的方法进行抽样、取样,尽量抽取有病毒危害症状的植物样品, BlScV的危害 症状描述参见附录A 。 7.2 样品制备 称取0.5 g 1.0 g待测样品按110 (质量体积,W/V)加入抽提缓冲液研磨, 4 下10 000 g离 心10 min ,上清即为样品提取液,用于DAS-ELISA 、免疫层析试纸条、巢式RT-PCR和实时荧光RT- PCR检测。 7.3 DAS-ELISA 具体方法按附录B检测。 7.4 免疫层析试纸条 具体方法按附录C检测。 7.5 巢式RT-PCR 具体方法按附录D检测。 7.6 实时荧光RT-PCR 具体方法按附录E检测。 7.

7、7 序列测定与比对 PCR产物纯化后,直接测序或者克隆测序,利用NCBI网站上的BLAST软件把测序所得到的核苷 酸序列与已知BlScV序列进行比对。 8 结果判定 样品检测时,检测结果判定按下述原则进行。 血清学检测( DAS-ELISA或免疫层析试纸条)初筛结果为阴性,且巢式RT-PCR或实时荧光 RT-PCR方法检测结果为阴性,则判定样品不携带BlScV 。 血清学检测( DAS-ELISA或免疫层析试纸条)初筛结果为阳性,则采用巢式RT-PCR或实时 荧光RT-PCR方法进行验证。若验证结果为阳性,则判定样品携带BlScV ;若验证结果为阴 性,则判定样品不携带BlScV 。 巢式RT

8、-PCR检测结果为阳性,且测定的序列为BlScV序列,则判定样品携带BlScV 。 巢式RT-PCR检测结果为阳性,且实时荧光RT-PCR检测结果为阳性,则判定样品携带 2 SN/T53852021 BlScV 。 9 结果记录与样品保存 9.1 结果记录 记录好各项实验数据,包括样品来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有经手人 和实验人员的签字。 DAS-ELISA检测结果保留吸光值数据报告;免疫层析试纸条保留试纸条检测图 片;巢式RT-PCR保留电泳照片;实时荧光RT-PCR保留实时荧光结果图片;序列测定保留电子文件。 9.2 样品保存 经检测结果判定为阳性的样品应妥善保

9、存在-20 或-80 冰箱中,并做好登记和标记工作,以 备复核用。 3 SN/T53852021 附 录 A (资料性) 蓝莓焦枯病毒的背景资料 A.1 寄主范围 目前已报道的自然寄主仅为蓝莓(Vaccinium s pp . )。 A.2 病害症状 受BlScV侵染的大多数蓝莓品种在开花时期突然出现花和叶片枯萎症状(图A.1 ),症状严重时导 致果实小或不结果,但在少数蓝莓品种上呈隐症现象。蓝莓感染BlScV后1年2年出现症状,开始1 2个枝条,最后蔓延至全株发病。 注:引自htt p :/ www.whatcom.wsu.edu / i p m / blue / scorch.html 。

10、 图A.1 BlScV侵染蓝莓引起的症状 A.3 分布地区 主要分布于美国、加拿大、荷兰、意大利、波兰等国家。 A.4 传播途径 主要通过蚜虫介体以非持久性方式传播。 A.5 粒体形态 病毒粒体呈线状,长约690 nm ,直径约14 nm 。 A.6 病毒基因组 正义单链RNA病毒,基因组全长约8.5 kb 。 4 SN/T53852021 附 录 B (规范性) 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) B.1 试剂 B.1.1 包被抗体 特异性的蓝莓焦枯病毒抗体。 B.1.2 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的蓝莓焦枯病毒抗体。 B.1.3 底物 对硝基苯磷酸二钠(pNPP )。 B.1

11、.4 1PBST缓冲液(pH7.4) 氯化钠( NaCl ) 8.0 g 磷酸二氢钾( KH 2 PO 4 ) 0.2 g 磷酸氢二钠( Na 2 HPO 4 ) 1.15 g 氯化钾( KCl ) 0.2 g 吐温-20 ( Tween-20 ) 0.5 mL 溶于900 mL灭菌双蒸水中,并定容至1 000 mL , 4 储存。 B.1.5 抽提缓冲液(pH7.4) 亚硫酸钠( Na 2 SO 3 ) 1.3 g 聚乙烯基吡咯烷酮( PVP , MW 24 00040 000 ) 20.0 g 溶于900 mL的1PBST中,并用1PBST定容至1 000 mL , 4 储存。 B.1.6

12、 包被缓冲液(pH9.6) 碳酸钠( Na 2 CO 3 ) 1.59 g 碳酸氢钠( NaHCO 3 ) 2.93 g 溶于900 mL灭菌双蒸水中,并定容至1 000 mL , 4 储存。 B.1.7 酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4) 牛血清白蛋白( BSA ) 2.0 g 聚乙烯基吡咯烷酮( PVP , MW 24 00040 000 ) 20.0 g 溶于900 mL 1PBST中,并用1PBST定容至1 000 mL , 4 储存。 B.1.8 底物缓冲液(pH9.8) 二乙醇胺97 mL 氯化镁( M g Cl 2 ) 0.1 g 5 SN/T53852021 溶于800 mL灭菌

13、双蒸水中,用浓盐酸( HCl )调p H至9.8 ,定容至1 000 mL , 4 储存。 B.2 程序 B.2.1 包被抗体 用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加入酶联板的孔中, 100 L /孔,加盖, 37 孵育2 h或4 冰箱 孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,按每孔100 L的量用PBST洗涤4次6次,每次1 min 。 B.2.2 加样 加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照和空白对照,并且至少一个重复, 100 L /孔,加盖, 37 孵育2 h或4 冰箱孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,按每孔100 L的量用 PBST洗涤4次 6次,每次1 min 。阴性对照为健康的植物组织(其种类和材

14、料应尽量与检测样品一致),阳性对照为感 染BlScV的植物组织,空白对照为样品抽提缓冲液。 B.2.3 加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,并加入到酶联板中, 100 L /孔,加盖, 37 孵育2 h ,倒去酶联板孔中溶液,按每孔100 L的量用PBST洗涤4次6次,每次1 min 。 B.2.4 加底物 将底物 NPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1 m g / mL (现配现用),按100 L /孔,加入到酶联板 中,室温避光孵育。 B.2.5 读数 阳性对照孔明显显色后,酶标仪在405 nm处读OD值。 B.3 结果判定 B.3.1 质量控制要求 满足阴性对照

15、孔的OD 405值5 ;同一样品 的重复性基本一致,数值差别2 ,判定为阳性;样品 OD 405值/阴性对照OD 405值在阈值附近,判定为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验证;样 品OD 405值/阴性对照OD 405值2 ,判定为阴性。 注: 若不满足B.3.1的质量控制要求,则不能进行结果判定。 6 SN/T53852021 附 录 C (规范性) 免疫层析试纸条检测 C.1 试剂 样品抽提缓冲液配制方法按照B.1.5执行。 C.2 程序 C.2.1 样品准备 待测样品按7.2步骤制备,取300 L样品液至1.5 mL的离心管中。 C.2.2 样品检测 检测前将试纸条恢复至室温。

16、将试纸条T线一端垂直插入到样品液中,样品液高度不要超过试纸 条上的MAX线。测试观察的时间以3 min6 min为宜。 注: 若病毒浓度较低,样品测试观察的时间可适当延长至10 min 。 C.3 结果判定 结果判定如下: 质控C线显红色,测试T线显红色,检测结果为阳性; 质控C线显红色,测试T线未显色,检测结果为阴性; 质控C线和测试T线均未显色,说明试纸条失效,检测结果无效。 C.4 试纸条是否有效的判断方法 判断方法如下: 用阳性对照进行测试,测试T线显红色,质控C线显红色,说明整个系统工作正常; 用阳性对照进行测试,测试T线显红色,质控C线未显色,说明羊抗兔失效; 用阳性对照进行测试,

17、测试T线未显色,质控C线显红色,说明测试T线的特异性抗体失效; 用阳性对照进行测试,若测试T线未显色,质控C线也未显色,说明整个测试纸条失效。 7 SN/T53852021 附 录 D (规范性) 巢式RT-PCR检测 D.1 试剂 D.1.1 TrizoL试剂 D.1.2 5TBE缓冲液 Tris碱 54.0 g 硼酸( H 3 BO 3 ) 27.5 g 0.5 mol / L EDTA ( p H8.0 ) 20.0 mL 补充蒸馏水至1 000 mL 。用时加蒸馏水稀释至0.5TBE 。 D.1.3 6加样缓冲液 0.25% 溴酚蓝 40% (W/V)蔗糖水溶液。 D.1.4 引物序列

18、 根据已报道的BlScV外壳蛋白(CP)基因序列设计用于特异性扩增的半巢式引物。 外侧正向引物BlScV-FP1 : 5 -CTCAAGCCGCAGCGTCACA-3 内侧正向引物BlScV-FP2 : 5 -GTACCCACCGAACAAGTTGC-3 反向引物BlScV-R : 5 -CACCAGTGTACTCCGTTTCGAGA-3 其中, BlScV-FP1 / BlScV-R引物对的目的片段大小为667 b p , BlScV-FP2 / BlScV-R引物对的目的 片段大小为448 b p 。 D.2 巢式RT-PCR检测 D.2.1 总RNA提取 取样品提取液200 L放入1.5

19、 mL离心管中,再加入1 mL TrizoL试剂,剧烈振荡摇匀3 min ; 4 下12 000g离心10 min ,取上清;加入三氯甲烷300 L ,剧烈振荡15 s ,室温静置5 min , 4 下12 000g 离心15 min ,取上层水相;加入等体积的异丙醇,颠倒混匀后室温下静置15 min , 4 下12 000g离心 10 min ,弃上清;加入1 mL 75%的乙醇洗涤沉淀2次,每次4 下7 500g离心3 min ,弃上清; RNA沉 淀干燥后,用20 L40 L经DEPC (焦碳酸二乙酯)处理过的ddH 2 O溶解, -80 保存备用。 注: 总RNA的提取也可以采用商品化

20、试剂盒。 D.2.2 cDNA合成 在PCR管中加入3 L总RNA , 1 L 随机引物( 100 mol / L )或1 L反向引物BlScV-R , ddH 2 O 7 L , 70 水浴10 min ,迅速冰浴5 min ,再加入下列试剂: 5RT缓冲液5 L 、 dNTPs ( 10 mmol / L ) 2 L 、 M-MLV RT ( 200 U / L ) 1 L 、 RNasin ( 40 U / L ) 1 L 。 42 水浴60 min , 70 水浴10 min ,自 然冷却至室温, -20 保存备用。 注: cDNA合成也可以采用商品化试剂盒。 8 SN/T538520

21、21 D.2.3 第1轮PCR扩增 第1轮PCR反应体系见表D.1 ,每个反应设置2个重复。检测时以含有病毒目标片段的质粒或含 病毒材料作为阳性对照,以不含病毒的健康植物组织作阴性对照,同时以水代替模板作为空白对照。 PCR反应条件: 94 预变性3 min ,然后94 变性30 s 、 53 退火45 s 、 72 延伸1 min , 35个循 环,最后一个循环结束后72 继续延伸10 min 。预期扩增片段大小667 b p 。 表D.1 PCR反应体系 名称加样量/ L cDNA 2.0 BlScV- FP1 ( 10 mol / L ) 1.0 BlScV-R ( 10 mol / L

22、 ) 1.0 2Taq PCR mix 12.5 ddH 2 O 8.5 总体积25.0 注: PCR扩增也可以采用商品化试剂盒。 D.2.4 第2轮PCR扩增 取第1轮PCR产物0.1 L作为模板,进行第2轮PCR扩增。 PCR反应体系为: BlScV-FP2 ( 10 mol / L ) 1 L , BlScV-R ( 10 mol / L ) 1 L , 2Taq PCR mix 12.5 L , ddH 2 O 10.4 L 。 PCR反应 条件: 94 预变性3 min ,然后94 变性30 s 、 58 退火45 s 、 72 延伸1 min , 30个循环,最后一个循 环结束后7

23、2 继续延伸10 min 。预期扩增片段大小448 b p 。 D.2.5 琼脂糖凝胶电泳 制备1.5%的琼脂糖凝胶,对PCR产物进行电泳,电压3-5 V / cm ,缓冲液0.5TBE 。电泳结束 后,在溴化乙锭( EB ,浓度为0.5 g / mL )溶液染色10 min后,再在凝胶成像分析系统中观察是否扩增 出预期的特异性DNA电泳带,拍照并做记录。 注: 也可以采用其他核酸染料替代EB 。 D.2.6 结果判断 如果阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品第1轮PCR扩增出与阳性对照一致的扩增条带 ( 667 b p )或第2轮PCR扩增出与阳性对照一致的扩增条带( 448 b p )

24、,则判定为阳性。 如果阳性对照、阴性对照和空白对照正常,待测样品第1轮PCR 、第2轮PCR均未出现与阳性对照 一致的扩增条带( 667 b p 、 448 b p ),则判定为阴性。 9 SN/T53852021 附 录 E (规范性) 实时荧光RT-PCR检测 E.1 试剂 核酸提取试剂见D.1.1 。 TaqMan PCR mix 。 E.2 引物及探针 根据已报道的BlScV外壳蛋白(CP)和依赖于RNA的RNA聚合酶( RdR p )基因序列设计用于实 时荧光RT-PCR检测的特异性引物及探针,引物及探针序列见表E.1 。 表E.1 实时荧光RT-PCR检测引物及探针 名称序列( 5

25、 -3 ) BlScV-f1 WGGKGGRCTTCARGGTGC BlScV-r1 GATCCATTRCCYGCATTTC BlScV-f2 GAWAAYTTYGAATGGTTYCGCT BlScV-r2 GRTGAGARTGCGGAAAACC BlScV-Probe1 FAM-CGTCCGCAATCAT-MGB BlScV-Probe2 FAM-YCTCAGYCCATACGC-MGB 注: K=G / T ; R= A / G ; W= A / T ; Y=C / T E.3 总RNA提取 方法见D.2.1 。 E.4 cDNA合成 在PCR管中加入3 L总RNA , 1 L 随机引物(

26、100 mol / L ), ddH 2 O 7 L , 70 水浴10 min ,迅 速冰浴5 min ,再加入下列试剂: 5 RT缓冲液5 L 、 dNTPs ( 10 mmol / L ) 2 L 、 M-MLV RT ( 200 U / L ) 1 L 、 RNasin ( 40 U / L ) 1 L 。 42 水浴60 min , 70 水浴10 min ,自然冷却至室温, -20 保存备用。 E.5 实时荧光PCR反应 反应体系:在荧光定量PCR管中加入2TaqMan PCR mix 12.5 L 、 BlScV-f1 ( 10 mol / L ) 1 L 、 BlScV-r1

27、( 10 mol / L ) 1 L 、 BlScV-f2 ( 10 mol / L ) 1 L 、 BlScV-r2 ( 10 mol / L ) 1 L 、 BlScV-Probe1 ( 10 mol / L ) 1 L 、 BlScV-Probe2 ( 10 mol / L ) 1 L 、模板cDNA 2 L ,补DEPC-H 2 O至25 L 。设置 阳性对照、阴性对照及空白对照,每个反应设置2个重复。 反应程序: 95 2 min ; 95 15 s , 60 1 min ,共40个循环。 注: 实时荧光PCR也可以采用商品化试剂盒。 01 SN/T53852021 E.6 结果判定

28、 在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值30并出现典型扩增曲线的条 件下: 待测样品的Ct值40时,判定BlScV阴性。 待测样品的Ct值35时,判定BlScV阳性。 待测样品的Ct值小于40而大于35时,应重新进行测试;如果重新测试的Ct值40 ,判定BlScV 阴性;如果重新测试的Ct值小于40而大于35 ,则判定BlScV阳性。 SN/T53852021 SN/T 53852021 参 考 文 献 1 Jevremovic D , Paunovic S , Le p osavic A.Incidence of viruses in hi g hbush blueberr

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