DB5306 T 71－2021 昭通市马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定DNA分子标记.pdf

《DB5306 T 71－2021 昭通市马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定DNA分子标记.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DB5306 T 71－2021 昭通市马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定DNA分子标记.pdf（13页珍藏版）》请在麦多课文档分享上搜索。

1、DB5306昭 通 市 地 方 标 准DB5306/T71 2021昭 通 市 马 铃 薯 品 种 真 实 性 和 种 薯 纯 度 鉴 定DNA分 子 标 记 2021 - 03 - 31发 布 2021 - 04 - 16实 施昭 通 市 市 场 监 督 管 理 局 发 布 ICS 65.020.20B 00 DB5306/T71 2021 I 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 给 出 的 规则 起 草 。本 文 件 由 昭 通 市 农 业 科 学 院 提 出 。本 文 件

2、由 昭 通 市 农 业 农 村 局 归 口 。本 文 件 起 草 单 位 ： 昭 通 市 农 业 科 学 院 、 云 南 师 范 大 学 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 李 周 、 胡 祚 、 李 灿 辉 、 刘 小 红 、 杨 健 康 、 王 韵 雪 、 李 志 芹 、 余 进 隆 、 李 怀 龙 、肖 德 琴 、 杨 菊 、 王 晓 娇 。 DB5306/T71 2021 1 昭 通 市 马 铃 薯 品 种 真 实 性 和 种 薯 纯 度 鉴 定 DNA 分 子 标 记1 范 围本 文 件 规 定 了 昭 通 市 DNA 分 子 标 记 鉴 定 马 铃 薯 （ Solanum tub

3、erosum L.） 品 种 的 方 法 。本 文 件 适 用 于 昭 通 市 马 铃 薯 品 种 真 实 性 鉴 定 和 种 薯 纯 度 检 测 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB 18133 马 铃 薯 种 薯GB/T 2

4、8660 马 铃 薯 种 薯 真 实 性 和 纯 度 鉴 定 SSR 分 子 标 记3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 毛 细 管 电 泳是 一 类 以 毛 细 管 为 分 离 通 道 、 以 高 压 直 流 电 场 为 驱 动 力 的 新 型 液 相 分 离 技 术 。3.2 DNA 分 子 标 记能 反 映 生 物 个 体 或 种 群 间 基 因 组 中 某 种 差 异 的 特 异 性 DNA 片 段 。 3.3 标 准 品 种取 得 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 非 主 要 农 作 物 品 种 登 记 证 书 的 马 铃

5、薯 品 种 。4 仪 器 用 具 、 试 剂 和 软 件4.1 仪 器 及 用 具 PCR 仪 （ 96 孔 ， 梯 度 ） 低 温 高 速 离 心 机 （ 4 ， 16000rpm/min） 冰 箱 （ -20 ， -80 ） 制 冰 机 (200kg-300kg/天 ) 高 压 灭 菌 器 （ 121 ， 0.15 MPa） 微 量 移 液 器 （ 0.5L 10L、 10L 100L、 100L 1000L） 及 配 套 的 枪 头 凝 胶 成 像 仪 DB5306/T712021 2 电 泳 仪 水 平 电 泳 槽 基 因 分 析 仪 （ Genetic Analyzer, ABI 3

6、500/3730 xl 系 列 ） 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 （ 190 nm-1100 nm） 0.2 mL PCR 管 96 孔 测 序 板 石 英 比 色 皿4.2 试 剂 常 用 贮 备 液 制 备 方 法 见 附 录 A DNA 提 取 试 剂 制 备 方 法 见 附 录 B DNA 分 子 标 记 引 物 见 附 录 C Taq DNA 聚 合 酶 （ Taq DNA polymerase） 和 配 套 的 PCR 缓 冲 液 1000 bp DNA Marker 无 DNA 酶 的 RNA 酶 A（ DNase-free RNase A） （ 10 mg/mL） 异 丙

7、 醇 乙 醇 （ 70%） 灭 菌 双 蒸 水 （ ddH2O） 甲 酰 胺 （ HIDI） 分 子 量 内 标 （ GeneScan 500LIZ） 核 酸 染 料4.3 软 件 Data Collection 4.0（ ABI） GeneMarker 2.09（ ABI） GeneMapper 4.0（ ABI） Microsoft Excel（ Microsoft corporation）5 供 试 材 料5.1 取 样 ： 按 照 GB 18133 取 样 所 述 方 法 进 行 ， 采 集 大 田 植 株 叶 片 或 块 茎 作 为 检 测 样 品 。5.2 样 品 保 存 ： 选

8、取 适 量 样 品 ， 装 入 冻 存 管 ， 液 氮 速 冻 ， 置 冰 箱 （ -80 以 下 ） 中 保 存 备 用 （ 有 效 保 存期 小 于 等 于 6 个 月 ） 。6 鉴 定 程 序6.1 总 DNA 提 取6.1.1 称 取 100mg 待 测 样 品 ， 置 于 预 冷 2.0mL 离 心 管 中 ， 液 氮 冷 冻 下 迅 速 研 磨 成 细 粉 。 6.1.2 依 次 加 入 700L 的 两 倍 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 缓 冲 液 （ CTAB 缓 冲 液 ） （ 见 附 录 B 表 B.1） 和 2L的 -巯 基 乙 醇 涡 旋 混 匀 ， 置 65

9、 水 浴 1 h， 期 间 每 隔 10min 摇 动 混 匀 一 次 。6.1.3 冰 上 冷 却 约 10min 后 ， 加 入 700L 的 氯 仿 ： 异 戊 醇 （ 24:1） 混 合 液 （ 见 附 录 B 表 B.2） ， 涡 旋 混合 ， 轻 缓 颠 倒 混 匀 数 次 。 DB5306/T71 2021 3 6.1.4 12000 rpm 离 心 5min， 吸 取 上 层 水 相 至 新 1.5mL 离 心 管 中 ， 加 入 等 体 积 （ 400L 500L） 的 预 冷异 丙 醇 ， 轻 缓 颠 倒 混 匀 。6.1.5 4 冰 箱 静 置 30min 后 ， 120

10、00rpm 离 心 15min， 弃 上 清 液 。6.1.6 向 离 心 管 中 加 入 70%乙 醇 1.0 mL， 静 置 3 min 后 ， 12000rpm 离 心 20min。6.1.7 小 心 倒 出 70%乙 醇 ， 再 加 入 90%乙 醇 1.0 mL， 静 置 5 min 后 ， 12000rpm 离 心 10min， 小 心 倒 去 乙醇 。6.1.8 在 干 净 的 吸 水 纸 上 倒 置 离 心 管 ， 自 然 干 燥 15min。6.1.9 加 入 100L 的 1TE 缓 冲 液 ， 将 十 倍 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 -乙 二 胺 四 乙 酸 缓 冲

11、液 （ EDTA 缓 冲 液 ） （ 见附 录 B 表 B.3） 稀 释 10 倍 并 灭 菌 溶 解 DNA， 再 加 入 2L 的 无 DNA 酶 的 RNA 酶 A（ 10 mg/mL） ， 37温 浴 1 h 去 除 RNA， 4 冰 箱 放 置 备 用 。6.2 总 DNA 质 量 检 测6.2.1 取 DNA 提 取 液 1.0L- 5.0L 于 新 的 1.5 mL 离 心 管 中 ， 加 入 1TE 缓 冲 液 稀 释 至 1.0mL， 混 匀 后 转 入 石 英 比 色 皿 中 ， 用 紫 外 分 光 光 度 计 测 定 OD260和 OD280下 的 光 密 度 值 （ O

12、D260： 紫 外 光 260nm 下 的光 密 度 值 ； OD280 ： 紫 外 光 280 nm 下 的 光 密 度 值 ） 。 用 OD260/OD280 比 值 判 断 DNA 纯 度 ， 比 值 在 1.81.9 之 间 表 明 DNA 纯 度 较 高 。 按 公 式 （ 1） 计 算 提 取 液 中 DNA 浓 度 。1000 50260 tODdsDNA .(1)式 （ 1） 中 ：dsDNA： 双 链 DNA分 子 的 含 量 （ g/mL）OD 260： 紫 外 光 260 nm下 的 光 密 度 值t： 稀 释 倍 数6.2.2 总 DNA 浓 度 确 定 后 ， 用 1

13、TE 缓 冲 液 将 所 提 取 的 总 DNA 稀 释 为 终 浓 度 50ng/L， 根 据 每 次 用 量分 装 ， 置 -20 冰 箱 保 存 备 用 。6.3 PCR 反 应6.3.1 PCR 反 应 体 系在 冰 盘 中 或 4 条 件 下 ， 按 表 1 所 列 成 分 及 其 用 量 ， 顺 序 依 次 加 入 PCR 管 ， 准 备 25.0L PCR 反 应体 系 。 表 1 PCR 反 应 体 系 成 分 用 量ddH2O 16.1 L10 PCR 缓 冲 液 2.5 LdNTPs (10 mM) 2.0 L正 向 引 物 (10 M) 1.0 L反 向 引 物 (10M

14、) 1.0 LTaq DNA 聚 合 酶 (2.5 U/L) 0.4 LDNA 模 板 (50 ng/L) 2.0 L DB5306/T712021 4 总 体 积 25.0 L注 ： 供 1 个 样 品 、 1 对 引 物 检 测 ， 25.0L6.3.2 反 应 程 序 :按 表 2程 序 设 置 PCR反 应 流 程 。 表 2 PCR 反 应 程 序反 应 程 序 时 间 备 注94 预 变 性 5 min94 变 性 1 min 退 火 1 min 不 同 引 物 所 需 的 退 火 温 度 见 附 录 C 表 C.172 延 伸 1 min循 环 次 数 35 次 变 性 退 火

15、延 伸 反 应 循 环 次 数72 延 伸 5 min4 终 止 反 应 PCR 产 物 放 置 在 4 冰 箱 中 保 存 备 用6.4 细 胞 质 标 记 检 测 用 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳6.4.1 器 具 清 洗将 配 胶 、 电 泳 、 染 胶 所 需 要 的 器 具 清 洗 干 净 ， 包 括 托 盘 、 胶 托 、 梳 子 、 电 泳 槽 、 染 胶 盘 。 清 洗 流 程为 ： 先 用 自 来 水 冲 洗 三 次 ， 然 后 用 纯 水 冲 洗 三 次 ， 最 后 用 纸 巾 或 医 用 纱 布 擦 干 。6.4.2 酶 切 反 应 酶 切 体 系 （ 10L)： 10Qu

16、ickCut Buffer 1L， 2U BamH I， PCR产 物 5L， 加 ddH2O至 10L， 混 匀 后于 30 水 浴 30min。6.4.3 配 胶制 备 好 的 凝 胶 需 平 整 、 不 漏 孔 ， 方 可 用 于 电 泳 检 测 。 制 胶 按 下 列 顺 序 进 行 ：1） 量 取 20mL 的 电 泳 缓 冲 液 1TAE 至 锥 形 瓶 中 。2） 再 称 取 0.4g 的 琼 脂 糖 倒 入 锥 形 瓶 中 ， 摇 匀 并 用 保 鲜 膜 封 口 。3） 放 入 微 波 炉 中 以 40%火 力 加 热 60s， 取 出 摇 匀 ， 再 次 放 入 微 波 炉

17、中 以 40%火 力 加 热 至 凝 胶 完 全溶 解 。 制 备 好 的 凝 胶 应 为 色 泽 均 匀 、 无 气 泡 。4） 将 制 备 好 的 凝 胶 放 入 65 的 水 浴 锅 中 ， 待 凝 胶 冷 却 至 65 时 ， 及 时 将 凝 胶 倒 入 装 配 好 的 干 净 胶槽 中 。5） 待 凝 胶 完 全 凝 固 后 ， 将 胶 槽 小 心 转 移 至 4 冰 箱 ， 冷 藏 30min 后 拔 出 梳 子 。6） 把 制 备 好 的 凝 胶 连 同 胶 托 一 起 放 入 电 泳 槽 正 中 央 ， 胶 孔 的 方 向 朝 向 负 极 ， 往 电 泳 槽 中 倒 入 电 泳

18、 缓 冲 液 （ 1TAE） 至 刚 好 将 凝 胶 淹 没 。6.4.4 上 样取 5L PCR产 物 ， 加 入 1L 6溴 酚 蓝 （ 见 附 录 A 表 A.4） 混 匀 ， 按 胶 孔 顺 序 上 样 并 做 好 记 录 ； 以 5 L的 DNA Ladder为 分 子 量 标 准 。 DB5306/T71 2021 5 6.4.5 电 泳在 电 压 120V或 400mA电 流 条 件 下 ， 电 泳 30min或 溴 酚 蓝 条 带 迁 移 距 至 胶 板 底 部 1cm时 停 止 。6.4.6 染 色电 泳 结 束 之 后 ， 把 凝 胶 转 移 到 Generadar核 酸

19、染 料 染 胶 盘 中 ， 盖 上 盖 子 避 光 染 色 30min。6.4.7 凝 胶 成 像将 凝 胶 放 入 凝 胶 成 像 系 统 中 ， 按 照 凝 胶 成 像 系 统 操 作 规 程 进 行 操 作 ， 拍 照 保 存 检 测 结 果 。6.5 细 胞 核 标 记 检 测 用 毛 细 管 电 泳 分 析6.5.1 内 标 配 置25mL Hi-Di和 193L GeneScan 500liz混 合 （ 130:1） ， 混 合 后 震 荡 15s， 根 据 每 次 使 用 量 分 装 至 1.5 mL 的 灭 菌 管 中 ， -20 冻 存 ， 使 用 前 4 解 冻 。6.5.

20、2 分 内 标将 解 冻 后 的 内 标 震 荡 混 匀 ， 分 别 加 入 96孔 板 ， 每 孔 9.0L。 若 每 批 次 检 测 样 品 不 足 96个 时 ， 空 白 的孔 加 入 ddH2O 10.0L， 用 封 口 膜 封 闭 内 标 板 ， 瞬 时 离 心 。6.5.3 加 样小 心 揭 去 内 标 板 的 封 口 膜 ， 吸 取 0.5L -1.0L的 待 检 测 样 品 PCR产 物 ， 按 顺 序 分 别 加 样 ， 再 次 用 封口 膜 封 闭 已 加 样 的 内 标 板 ， 并 用 吸 水 纸 压 紧 。6.5.4 变 性震 荡 10s混 匀 ， 3900rpm离 心

21、 5 min后 ， 放 入 PCR仪 中 96 变 性 处 理 5min， 再 迅 速 冷 冻 （ -20 ） 2min，瞬 时 离 心 。 6.5.5 电 泳 与 分 析按 照 基 因 分 析 仪 （ ABI 3500/3730 xl） 操 作 流 程 进 行 电 泳 、 数 据 收 集 。 用 软 件 GeneMarker和GeneMapper进 行 数 据 分 析 ， 最 后 用 软 件 Excel进 行 数 据 统 计 。7 数 据 记 录 和 分 析7.1 细 胞 质 DNA 标 记 检 测 结 果7.1.1 叶 绿 体 DNA标 记 检 测 ： ALC1/3标 记 检 测 结 果

22、分 为 两 种 带 型 （ 662 bp或 381 bp） ， 以 区 分 普 通 栽 培亚 种 （ T,带 型 381 bp） 和 野 生 种 （ W,622 bp） 的 叶 绿 体 DNA类 型 。 A标 记 PCR扩 增 产 物 经 BamH I酶 切 后检 测 结 果 分 为 有 或 无 250 bp特 征 条 带 ， 有 代 表 安 第 斯 栽 培 类 群 （ Andigenum Group） 叶 绿 体 DNA类 型 （ A型 ） 。7.1.2 线 粒 体 DNA标 记 检 测 ： ALM4/5标 记 检 测 结 果 为 2400 bp、 1600 bp或 无 特 异 性 扩 增

23、产 物 ， 可 将 线 粒 体 DNA类 型 分 别 分 为 、 或 三 种 。7.2 细 胞 核 DNA 标 记 检 测 结 果 DB5306/T712021 6 7.2.1 SSR引 物 （ STG0001） 标 记 检 测 ： 在 119 bp 143 bp分 子 量 大 小 范 围 内 有 无 扩 增 峰 ， 根 据 峰 值 的 位置 和 个 数 进 行 判 断 。7.7.2 SSR引 物 （ STI0036） 标 记 检 测 ： 在 114 bp 138 bp分 子 量 大 小 范 围 内 有 无 扩 增 峰 ， 根 据 峰 值 的 位 置和 个 数 进 行 判 断 。7.2.3 S

24、SR引 物 （ STM0030） 标 记 检 测 ： 在 113 bp 158 bp分 子 量 大 小 范 围 内 有 无 扩 增 峰 ， 根 据 峰 值 的 位置 和 个 数 进 行 判 断 。7.2.4 SSR引 物 （ STM2013） 标 记 检 测 ： 在 139 bp 165 bp分 子 量 大 小 范 围 内 有 无 扩 增 峰 ， 根 据 峰 值 的 位置 和 个 数 进 行 判 断 。8 结 果 判 定8.1 品 种 真 实 性 鉴 定 8.1.1 直 接 比 较 待 测 品 种 与 标 准 品 种 样 品 的 标 记 检 测 结 果 ， 方 法 如 下 ：8.1.2 首 先

25、 判 定 叶 绿 体 与 线 粒 体 DNA 标 记 类 型 ， 如 电 泳 带 型 与 标 准 样 品 不 一 致 ， 则 判 定 和 待 测 品 种 不一 致 ， 不 进 入 检 测 。8.1.3 如 叶 绿 体 和 线 粒 体 DNA 标 记 检 测 带 型 一 致 ， 则 根 据 4 个 核 基 因 组 SSR 标 记 检 测 结 果 进 行 判 定 。若 待 测 品 种 样 品 与 标 准 品 种 样 品 之 间 所 有 条 带 数 目 和 峰 位 完 全 吻 合 ， 则 判 定 待 测 品 种 和 标 准 品 种 为 同 一品 种 ； 如 存 在 不 一 致 条 带 和 峰 值 ，

26、 则 判 定 为 不 是 同 一 品 种 。8.2 种 薯 纯 度 检 测根 据 待 检 测 样 品 数 量 ， 在 逐 一 提 取 样 品 基 因 组 DNA后 ， 可 采 取 混 合 样 品 （ 5 10个 样 品 DNA等 量 混合 为 一 个 混 合 样 品 ） 检 测 。 按 8.1结 果 判 定 流 程 ， 如 判 定 为 同 一 样 品 ， 则 品 种 纯 度 （ P） 记 为 100%。 如检 测 结 果 低 于 100%， 则 对 有 差 异 的 混 合 样 品 分 别 进 行 逐 一 检 测 ， 最 后 根 据 有 差 异 的 检 测 样 品 数 量 （ S）占 总 抽 样

27、 检 测 样 品 数 量 （ T） 的 百 分 比 来 判 定 品 种 纯 度 ， 按 照 公 式 （ 2） 进 行 计 算 ：%1001 TSP .(2)式 （ 2） 中 ：P： 种 薯 纯 度 （ %） ；S： 有 差 异 的 检 测 样 品 数 量 ；T： 总 抽 样 检 测 样 品 数 量 。 DB5306/T71 2021 7 附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）常 用 贮 备 液表 A.l 表 A.4 给 出 了 常 用 贮 备 液 的 配 制 方 法 。表 A.1 为 1.0mol/L 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 -盐 酸 贮 备 液 （ Tris-HCl贮 备 液 ） （

28、pH8.0， 1000mL） 。表 A.1 Tris-HCl 贮 备 液成 分 用 量 备 注三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 （ Tris 碱 ） 121.1 g灭 菌 双 蒸 水 (ddH 2O) 800 mL37%浓 盐 酸 (HCl) 约 42 mL 用 约 42 mL 浓 盐 酸 调 节 pH 值 至 8.0最 终 体 积 1000 mL 用 ddH2O 定 容 至 1000 mL。 灭 菌 后 ， 室 温 保 存表 A.2 为 0.5 mol/L 乙 二 胺 四 乙 酸 贮 备 液 (EDTA贮 备 液 ） （ pH 8.0， 1000 mL)。表 A.2 EDTA贮 备 液成 分

29、用 量 备 注乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 (Na2EDTA-2H 2O) 186.1 g灭 菌 双 蒸 水 (ddH2O) 700 mL10 mol/L 氢 氧 化 钠 (NaOH) 约 50 mL 用 约 50 mL 氢 氧 化 钠 调 节 pH 值 至 8.0最 终 体 积 1000 mL 用 ddH2O 定 容 至 1000 mL。 灭 菌 后 ， 室 温 保 存表 A.3 为 十 倍 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 -硼 酸 -乙 二 胺 四 乙 酸 缓 冲 液 （ 50TAE缓 冲 液 ） （ pH 8.0， 1000mL） 。 表 A.3 50TAE 缓 冲 液成 分 用 量

30、备 注Tris 碱 (Tris base) 242 g冰 醋 酸 (Acetic acid) 57.1 mL 0.05 M EDTA(pH 8.0) 100 mL灭 菌 双 蒸 水 (ddH2O) 800 mL 用 ddH2O 定 容 至 1000 mL最 终 体 积 1000 mL 灭 菌 后 ， 室 温 保 存表 A.4 为 电 泳 上 样 缓 冲 液 （ 50 mL） 。表 A.4 上 样 缓 冲 液成 分 用 量 备 注98%甲 酰 胺 (Formamide) 47 mL0.2 M EDTA(pH8.0) 2.5 mL溴 酚 蓝 （ Bromophenol） 0.25g 也 可 用 5

31、 mL ddH 2O 溶 解 后 ， 按 需 要 量 加 入二 甲 苯 青 （ Xylene cyanol） 0.25g最 终 体 积 50 mL 4 冰 箱 保 存 DB5306/T712021 8 AB附 录 B（ 规 范 性 附 录 ）DNA 提 取 试 剂表 B.1 为 2X十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 缓 冲 液 （ 2 CTAB缓 冲 液 ） (pH 8.0， 1000 mL)。表 B.1 2 CTAB 缓 冲 液成 分 用 量 备 注 1.0 M Tris-HCl (pH8.0) 100 mL0.5 M EDTA(pH8.0) 40 mL氯 化 钠 (NaCl) 81.

32、82 g 加 入 600 mL ddH2O 加 热 搅 拌十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 (CTAB) 20 g聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 (PVP) 2 g灭 菌 双 蒸 水 (ddH2O) 用 ddH2O 定 容 至 1000 mL最 终 体 积 1000 mL 灭 菌 后 ， 室 温 保 存表 B.2 为 氯 仿 ： 异 戊 醇 混 合 液 (24： 1， 100 mL)。表 B.2 氯 仿 ： 异 戊 醇 混 合 液 成 分 用 量 备 注氯 仿 (Chloroform) 96 mL异 戊 醇 (Isoamylol) 4 mL最 终 体 积 100 mL 临 时 配 制表 B.

33、3 为 十 倍 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 -乙 二 胺 四 乙 酸 缓 冲 液 （ 10 TE缓 冲 液 ） （ pH 8.0， 1000 mL） 。表 B.3 10 TE 缓 冲 液成 分 用 量 备 注1.0 M Tris-HCl (pH 8.0) 100 mL0.5 M EDTA(pH 8.0) 20 mL 灭 菌 双 蒸 水 (ddH2O) 800 mL 用 ddH2O 定 容 至 1000 mL最 终 体 积 1000 mL 灭 菌 后 ， 室 温 保 存 DB5306/T71 2021 9 BC附 录 C（ 规 范 性 附 录 ）引 物表 C.1 为 细 胞 质 和 细 胞

34、核 引 物 信 息 表 。表 C.1 引 物 信 息引 物 名 称 SSR 基 序 引 物 序 列 (53) 退 火 温 度 ( ) 染 色 体 预 期 产 物 (bp)ALC1/3 - F: TAGAATCAGGAGGTCTTR: TTACTCACGGCAATC 55 cpDNA 381/622A - F:AACTTTTTGAACTCTATTCCTTAATTGR:ACGCTTCATTAGCCCATACC 60 cpDNA 1200/250ALM4/5 - F:AATAATCTTCCAAGCGGAGAGR:AAGACTCGTGATTCAGGCAAT 57 mtDNA 2400/1600/N*S

35、TM2013 （ TCTA） 6 F:TTCGGAATTACCCTCTGCCR:AAAAAAAGAACGCGCACG 55 146-172STM0030 (GT/GC)(GT)n F:AGAGATCGATGTAAAACACGTR: GTGGCATTTTGATGGATT 58 XII 122 168STG0001 (CT)n F: CAGCCAACATTTGTACCCCTR: ACCCCCACTTGCCATATTTT 58 XI 137-163STI0036 (AC)n(TC)n F: GGACTGGCTGACCATGAACTR: TTACAGGAAATGCAAACTTCG 55 II 129-164*： 无 条 带 扩 增 _