DB53 T 1059.1-2021 滇金丝猴检疫技术 第1部分:产气荚膜梭菌实验室检测技术规范.pdf
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1、ICS 11.220CCS B 41 53云 南 省 地 方 标 准DB53/T 1059.12021滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 第 1 部 分 : 产 气 荚 膜梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 Quarantine technique for Rhinopithecus bietiPart 1: Technical specifications for laboratory examination ofClostridium perfringens 2021 - 09 - 30发 布 2021 - 10 - 14实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB53/
2、T 1059.1 2021 I 目 次前 言 .III引 言 .1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 缩 略 语 .25 总 则 .26 产 气 荚 膜 梭 菌 分 型 .3 7 仪 器 设 备 和 试 剂 .37.1 采 样 用 品 .37.2 实 验 材 料 .37.3 实 验 设 备 .38 样 品 .38.1 采 样 要 求 .48.2 采 样 程 序 .48.3 样 品 保 存 与 运 输 .49 试 验 步 骤 .49.1 细 菌 分 离 培 养 及 培 养 特 性 观 察 .49.2 革 兰 染 色 和 芽 孢 染 色 镜 检 .4
3、9.3 细 菌 生 化 试 验 .49.4 小 鼠 接 种 试 验 .49.5 16S rRNA 基 因 与 4 种 毒 素 基 因 的 PCR 扩 增 及 测 序 分 析 .510 试 验 数 据 处 理 .510.1 细 菌 培 养 结 果 判 定 .510.2 染 色 镜 检 结 果 判 读 .510.3 生 化 试 验 结 果 判 定 .610.4 小 鼠 毒 性 试 验 结 果 判 定 .610.5 毒 素 中 和 试 验 结 果 判 定 .610.6 核 酸 检 测 结 果 判 定 .6附 录 A( 规 范 性 ) 引 物 和 16S rRNA 基 因 PCR 扩 增 体 系 .7
4、附 录 B( 规 范 性 ) 采 样 记 录 表 .8 附 录 C( 规 范 性 ) 革 兰 染 色 和 雪 -浮 染 色 方 法 . 9附 录 D( 规 范 性 ) TA克 隆 程 序 .10 DB53/T 1059.1 2021 III 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 : 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草 。 本 文 件 是 DB53/T 1059 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 的 第 1部 分 。 DB53/T 1059已 经 发 布 了 以 下 部 分 : 第 1 部 分 : 产 气
5、荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ; 第 2 部 分 : 毛 首 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ; 第 3 部 分 : 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ; 第 4 部 分 : 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局 、 云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 共 同 提 出 。 本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术
6、委 员 会 ( YNTC02) 归 口 。本 文 件 主 要 起 草 单 位 : 云 南 农 业 大 学 、 云 南 省 标 准 化 研 究 院 。本 文 件 起 草 人 : 陈 培 富 、 黄 艳 梅 、 卓 娜 、 朱 勋 程 、 胡 世 享 、 李 宁 、 何 依 蓉 、 钱 丽 敏 、 邹 丰 才 、 杨 建发 。 DB53/T 1059.1 2021 引 言滇 金 丝 猴 ( Rhinopithecus bieti) 是 中 国 特 有 珍 稀 濒 危 灵 长 类 动 物 , 属 于 国 家 级 重 点 保 护 野 生 动 物 ,列 入 世 界 自 然 保 护 联 盟 ( IUCN)
7、 濒 危 物 种 红 色 名 录 。 编 制 并 发 布 DB53/T 1059 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 地 方 标 准 , 推 进 滇 金 丝 猴 疫 病 诊 断 的 标 准 化 和 规 范 化 , 指 导 从 事 野 生 动 物 保 护 相 关 的 专 业 人 员 按 规 范 程序 实 施 对 滇 金 丝 猴 相 关 病 原 的 实 验 室 检 测 , 为 滇 金 丝 猴 的 科 学 研 究 和 保 护 工 作 提 供 病 原 或 疫 病 调 查 的 基础 数 据 , 为 滇 金 丝 猴 检 疫 、 疫 病 监 测 和 防 治 提 供 重 要 的 参 考 依 据 , 促 进 滇 金
8、 丝 猴 繁 育 和 扩 群 , 维 护 地 区物 种 与 生 态 平 衡 , 提 升 生 物 多 样 性 保 护 成 效 。本 文 件 已 发 布 4个 部 分 : 第 1 部 分 : 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、产 气 荚 膜 梭 菌 分 型 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ; 第 2 部 分 : 毛 首 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 毛 首 线 虫
9、 实 验 室 检 测 技 术 规 范 的 试 验 原 理 、试 验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 采 集 与 保 存 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ; 第 3 部 分 : 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 的 试 验 原 理 、 试验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ; 第 4 部 分 : 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。
10、 本 部 分 从 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 涉 及 的 总 则 、 志贺 杆 菌 分 类 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 。 DB53/T 1059.1 2021 1 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术第 1 部 分 : 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范重 要 提 示 : 本 文 件 涉 及 人 兽 共 患 病 原 体 的 操 作 , 应 在 符 合 国 家 相 关 生 物 安 全 规 定 ( GB 19489和NY/T 541) 的 条 件 下 进 行 。 本
11、文 件 遵 循 3R原 则 开 展 动 物 试 验 。1 范 围本 文 件 规 定 了 滇 金 丝 猴 ( Rhinopithecus bieti) 检 疫 技 术 中 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、 产气 荚 膜 梭 菌 分 型 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 和 试 验 数 据 处 理 。本 文 件 适 用 于 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 中 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 。 2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必
12、不 可 少 的 条 款 。 其 中 , 注 日 期 的 引 用 文 件 ,仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ; 不 注 日 期 的 引 用 文 件 , 其 最 新 版 本 ( 包 括 所 有 的 修 改 单 ) 适 用 于 本文 件 。GB 19489 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求NY/T 541 兽 医 诊 断 样 品 采 集 、 保 存 与 运 输 技 术 规 范3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 产 气 荚 膜 梭 菌 Clostridium perfringens 产 气 荚 膜 梭 菌 旧 称 魏
13、 氏 梭 菌 , 为 梭 状 芽 孢 杆 菌 属 中 的 一 种 厌 氧 革 兰 阳 性 杆 菌 , 属 于 条 件 性 致 病 菌 ,主 要 分 布 于 动 物 胃 肠 道 , 通 过 分 泌 外 毒 素 发 生 致 病 作 用 。3.2 3R 原 则 the 3R principles开 展 涉 及 实 验 动 物 的 科 学 研 究 , 对 实 验 动 物 采 取 减 少 ( Reduction) 、 优 化 ( Refinement) 和 替 代( Replacement) 的 动 物 福 利 保 障 措 施 。3.3 细 菌 生 化 试 验 biochemical tests for
14、 bacteria根 据 不 同 种 类 细 菌 产 生 的 酶 系 统 及 其 可 分 解 底 物 的 种 类 的 差 异 , 测 定 代 谢 产 物 种 类 用 来 区 别 和 鉴 定细 菌 。3.4 外 毒 素 exotoxin病 原 细 菌 分 泌 、 释 放 于 其 生 存 环 境 或 动 物 体 内 的 毒 性 蛋 白 质 或 多 肽 , 能 结 合 并 破 坏 宿 主 细 胞 的 正 常 结 构 与 功 能 。 DB53/T 1059.1 2021 2 3.5 小 鼠 接 种 试 验 inoculation test in mice小 鼠 接 种 试 验 包 括 小 鼠 毒 性
15、试 验 和 毒 素 中 和 试 验 , 用 于 鉴 定 产 气 荚 膜 梭 菌 及 其 外 毒 素 类 型 。3.6 保 定 physical restraint采 用 化 学 或 物 理 方 式 , 让 动 物 固 定 保 持 某 种 姿 势 或 某 个 体 位 , 以 便 于 救 护 人 员 进 行 检 查 、 采 样 或 治疗 。 可 用 麻 醉 药 物 或 镇 静 剂 保 定 , 也 用 特 制 笼 具 、 平 台 、 布 袋 、 绳 索 以 及 其 它 方 式 保 定 。3.7 TA 克 隆 TA cloning使 用 Taq DNA聚 合 酶 做 PCR扩 增 得 到 的 产 物
16、, 凭 借 其 DNA链 的 3-端 碱 基 A与 质 粒 载 体 ( 如 pMD18-T或 pMD19-T) 的 5-端 碱 基 T互 补 配 对 , 将 PCR产 物 插 入 质 粒 载 体 。4 缩 略 语 下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件 。Amp: 氨 苄 青 霉 素 Ampecillinbp: 碱 基 对 Base pairBHI: 脑 心 浸 液 Brain heart infusionBLAST: 基 于 局 部 序 列 比 对 算 法 的 搜 索 工 具 Basic local alignment search toolddH2O: 双 蒸 水 Double dis
17、tilled waterCPA: 产 气 荚 膜 梭 菌 毒 素 Clostridium perfringens toxinCPB: 产 气 荚 膜 梭 菌 毒 素 Clostridium perfringens toxinCW: 魏 氏 梭 菌 Clostridium welchiiDNA: 脱 氧 核 糖 核 酸 Deoxyribonucleic acidETX: 毒 素 toxinITX: 毒 素 toxinPCR: 聚 合 酶 链 式 反 应 Polymerase chain reaction SPS: 亚 硫 酸 盐 -多 粘 菌 素 -磺 胺 嘧 啶 Sulfite-Polymyx
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