1、ICS 11.220CCS B 41 53云 南 省 地 方 标 准DB53/T 1059.12021滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 第 1 部 分 ： 产 气 荚 膜梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 Quarantine technique for Rhinopithecus bietiPart 1: Technical specifications for laboratory examination ofClostridium perfringens 2021 - 09 - 30发 布 2021 - 10 - 14实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB53/
2、T 1059.1 2021 I 目 次前 言 .III引 言 .1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 缩 略 语 .25 总 则 .26 产 气 荚 膜 梭 菌 分 型 .3 7 仪 器 设 备 和 试 剂 .37.1 采 样 用 品 .37.2 实 验 材 料 .37.3 实 验 设 备 .38 样 品 .38.1 采 样 要 求 .48.2 采 样 程 序 .48.3 样 品 保 存 与 运 输 .49 试 验 步 骤 .49.1 细 菌 分 离 培 养 及 培 养 特 性 观 察 .49.2 革 兰 染 色 和 芽 孢 染 色 镜 检 .4
3、9.3 细 菌 生 化 试 验 .49.4 小 鼠 接 种 试 验 .49.5 16S rRNA 基 因 与 4 种 毒 素 基 因 的 PCR 扩 增 及 测 序 分 析 .510 试 验 数 据 处 理 .510.1 细 菌 培 养 结 果 判 定 .510.2 染 色 镜 检 结 果 判 读 .510.3 生 化 试 验 结 果 判 定 .610.4 小 鼠 毒 性 试 验 结 果 判 定 .610.5 毒 素 中 和 试 验 结 果 判 定 .610.6 核 酸 检 测 结 果 判 定 .6附 录 A（ 规 范 性 ） 引 物 和 16S rRNA 基 因 PCR 扩 增 体 系 .7
4、附 录 B（ 规 范 性 ） 采 样 记 录 表 .8 附 录 C（ 规 范 性 ） 革 兰 染 色 和 雪 -浮 染 色 方 法 . 9附 录 D（ 规 范 性 ） TA克 隆 程 序 .10 DB53/T 1059.1 2021 III 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草 。 本 文 件 是 DB53/T 1059 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 的 第 1部 分 。 DB53/T 1059已 经 发 布 了 以 下 部 分 ： 第 1 部 分 ： 产 气
5、荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 2 部 分 ： 毛 首 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 3 部 分 ： 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 4 部 分 ： 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局 、 云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 共 同 提 出 。 本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术
6、委 员 会 （ YNTC02） 归 口 。本 文 件 主 要 起 草 单 位 ： 云 南 农 业 大 学 、 云 南 省 标 准 化 研 究 院 。本 文 件 起 草 人 ： 陈 培 富 、 黄 艳 梅 、 卓 娜 、 朱 勋 程 、 胡 世 享 、 李 宁 、 何 依 蓉 、 钱 丽 敏 、 邹 丰 才 、 杨 建发 。 DB53/T 1059.1 2021 引 言滇 金 丝 猴 （ Rhinopithecus bieti） 是 中 国 特 有 珍 稀 濒 危 灵 长 类 动 物 ， 属 于 国 家 级 重 点 保 护 野 生 动 物 ，列 入 世 界 自 然 保 护 联 盟 （ IUCN）
7、 濒 危 物 种 红 色 名 录 。 编 制 并 发 布 DB53/T 1059 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 地 方 标 准 ， 推 进 滇 金 丝 猴 疫 病 诊 断 的 标 准 化 和 规 范 化 ， 指 导 从 事 野 生 动 物 保 护 相 关 的 专 业 人 员 按 规 范 程序 实 施 对 滇 金 丝 猴 相 关 病 原 的 实 验 室 检 测 ， 为 滇 金 丝 猴 的 科 学 研 究 和 保 护 工 作 提 供 病 原 或 疫 病 调 查 的 基础 数 据 ， 为 滇 金 丝 猴 检 疫 、 疫 病 监 测 和 防 治 提 供 重 要 的 参 考 依 据 ， 促 进 滇 金
8、 丝 猴 繁 育 和 扩 群 ， 维 护 地 区物 种 与 生 态 平 衡 ， 提 升 生 物 多 样 性 保 护 成 效 。本 文 件 已 发 布 4个 部 分 ： 第 1 部 分 ： 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、产 气 荚 膜 梭 菌 分 型 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 2 部 分 ： 毛 首 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 毛 首 线 虫
9、 实 验 室 检 测 技 术 规 范 的 试 验 原 理 、试 验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 采 集 与 保 存 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 3 部 分 ： 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 的 试 验 原 理 、 试验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 4 部 分 ： 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。
10、 本 部 分 从 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 涉 及 的 总 则 、 志贺 杆 菌 分 类 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 。 DB53/T 1059.1 2021 1 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术第 1 部 分 ： 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范重 要 提 示 ： 本 文 件 涉 及 人 兽 共 患 病 原 体 的 操 作 ， 应 在 符 合 国 家 相 关 生 物 安 全 规 定 （ GB 19489和NY/T 541） 的 条 件 下 进 行 。 本
11、文 件 遵 循 3R原 则 开 展 动 物 试 验 。1 范 围本 文 件 规 定 了 滇 金 丝 猴 （ Rhinopithecus bieti） 检 疫 技 术 中 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、 产气 荚 膜 梭 菌 分 型 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 和 试 验 数 据 处 理 。本 文 件 适 用 于 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 中 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 。 2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必
12、不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本文 件 。GB 19489 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求NY/T 541 兽 医 诊 断 样 品 采 集 、 保 存 与 运 输 技 术 规 范3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 产 气 荚 膜 梭 菌 Clostridium perfringens 产 气 荚 膜 梭 菌 旧 称 魏
13、 氏 梭 菌 ， 为 梭 状 芽 孢 杆 菌 属 中 的 一 种 厌 氧 革 兰 阳 性 杆 菌 ， 属 于 条 件 性 致 病 菌 ，主 要 分 布 于 动 物 胃 肠 道 ， 通 过 分 泌 外 毒 素 发 生 致 病 作 用 。3.2 3R 原 则 the 3R principles开 展 涉 及 实 验 动 物 的 科 学 研 究 ， 对 实 验 动 物 采 取 减 少 （ Reduction） 、 优 化 （ Refinement） 和 替 代（ Replacement） 的 动 物 福 利 保 障 措 施 。3.3 细 菌 生 化 试 验 biochemical tests for
14、 bacteria根 据 不 同 种 类 细 菌 产 生 的 酶 系 统 及 其 可 分 解 底 物 的 种 类 的 差 异 ， 测 定 代 谢 产 物 种 类 用 来 区 别 和 鉴 定细 菌 。3.4 外 毒 素 exotoxin病 原 细 菌 分 泌 、 释 放 于 其 生 存 环 境 或 动 物 体 内 的 毒 性 蛋 白 质 或 多 肽 ， 能 结 合 并 破 坏 宿 主 细 胞 的 正 常 结 构 与 功 能 。 DB53/T 1059.1 2021 2 3.5 小 鼠 接 种 试 验 inoculation test in mice小 鼠 接 种 试 验 包 括 小 鼠 毒 性
15、试 验 和 毒 素 中 和 试 验 ， 用 于 鉴 定 产 气 荚 膜 梭 菌 及 其 外 毒 素 类 型 。3.6 保 定 physical restraint采 用 化 学 或 物 理 方 式 ， 让 动 物 固 定 保 持 某 种 姿 势 或 某 个 体 位 ， 以 便 于 救 护 人 员 进 行 检 查 、 采 样 或 治疗 。 可 用 麻 醉 药 物 或 镇 静 剂 保 定 ， 也 用 特 制 笼 具 、 平 台 、 布 袋 、 绳 索 以 及 其 它 方 式 保 定 。3.7 TA 克 隆 TA cloning使 用 Taq DNA聚 合 酶 做 PCR扩 增 得 到 的 产 物
16、， 凭 借 其 DNA链 的 3-端 碱 基 A与 质 粒 载 体 （ 如 pMD18-T或 pMD19-T） 的 5-端 碱 基 T互 补 配 对 ， 将 PCR产 物 插 入 质 粒 载 体 。4 缩 略 语 下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件 。Amp： 氨 苄 青 霉 素 Ampecillinbp： 碱 基 对 Base pairBHI： 脑 心 浸 液 Brain heart infusionBLAST： 基 于 局 部 序 列 比 对 算 法 的 搜 索 工 具 Basic local alignment search toolddH2O： 双 蒸 水 Double dis
17、tilled waterCPA： 产 气 荚 膜 梭 菌 毒 素 Clostridium perfringens toxinCPB： 产 气 荚 膜 梭 菌 毒 素 Clostridium perfringens toxinCW： 魏 氏 梭 菌 Clostridium welchiiDNA： 脱 氧 核 糖 核 酸 Deoxyribonucleic acidETX： 毒 素 toxinITX： 毒 素 toxinPCR： 聚 合 酶 链 式 反 应 Polymerase chain reaction SPS： 亚 硫 酸 盐 -多 粘 菌 素 -磺 胺 嘧 啶 Sulfite-Polymyx
18、in-SulphadiazineTAE： 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 -乙 酸 -乙 二 胺 四 乙 酸 钠 Tris-Acetate-EDTATris： 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 Tris(hydroxymethyl)aminomethaneTSC： 胰 蛋 白 -亚 硫 酸 盐 -环 丝 氨 酸 Tryptose-Sulphite-Cycloserine5 总 则5.1 培 养 特 性 ： 对 滇 金 丝 猴 开 展 产 气 荚 膜 梭 菌 检 测 ， 采 集 新 鲜 的 腹 泻 粪 便 样 品 ， 经 增 菌 厌 氧 培 养 ， 转种 细 菌 于 选 择 性 琼 脂 培 养 基
19、 继 续 做 厌 氧 培 养 ， 获 得 具 有 溶 血 能 力 、 暴 烈 发 酵 含 铁 牛 乳 特 性 ， 并 在 SPS或 TSC 琼 脂 形 成 黑 色 菌 落 的 分 离 菌 株 。5.2 形 态 观 察 ： 对 分 离 菌 株 做 革 兰 染 色 和 芽 孢 染 色 镜 检 ， 排 除 不 符 合 产 气 荚 膜 梭 菌 基 本 形 态 学 特 征 的其 他 杆 菌 ， 减 少 得 出 假 阳 性 结 果 的 可 能 。5.3 生 化 试 验 ： 做 细 菌 生 化 试 验 ， 将 符 合 气 荚 膜 梭 菌 生 化 特 性 的 分 离 菌 株 基 本 确 定 为 产 气 荚 膜
20、 梭 菌 ， 进 一 步 排 除 非 目 标 菌 种 。5.4 动 物 试 验 ： 取 符 合 产 气 荚 膜 梭 菌 生 化 特 性 的 分 离 菌 株 ， 制 备 培 养 物 上 清 滤 过 液 ， 做 小 鼠 毒 性 试 验和 毒 素 中 和 试 验 ， 从 致 病 性 角 度 对 分 离 菌 株 做 出 产 气 荚 膜 梭 菌 菌 种 及 毒 素 型 的 常 规 判 定 。 DB53/T 1059.1 2021 3 5.5 分 子 鉴 定 ： 通 过 PCR 扩 增 分 析 分 离 菌 株 的 16S rRNA 基 因 和 4 种 毒 素 基 因 ， 得 出 最 终 鉴 定 结 果 。
21、6 产 气 荚 膜 梭 菌 分 型根 据 产 气 荚 膜 梭 菌 产 生 的 外 毒 素 种 类 ， 传 统 上 将 该 菌 分 为 A、 B、 C、 D、 E五 个 毒 素 型 ：a) A 型 只 产 生 毒 素 ；b) B 型 产 生 、 、 三 种 毒 素 ；c) C 型 产 生 、 两 种 毒 素 ；d) D 型 产 生 、 两 种 毒 素 ；e) E 型 产 生 、 两 种 毒 素 。注 ： 、 、 和 毒 素 又 称 作 CPA、 CPB、 ETX和 ITX。7 仪 器 设 备 和 试 剂 7.1 采 样 用 品7.1.1 个 人 防 护 装 备 ： 包 括 防 护 服 、 乳 胶
22、 手 套 或 聚 乙 烯 手 套 、 +/-N95 或 FFP2 面 罩 、 护 目 镜 、 鞋 套等 。7.1.2 样 品 采 集 及 记 录 用 品 ： 包 括 装 有 保 存 介 质 的 采 样 管 或 无 菌 空 容 器 、 动 物 检 疫 器 械 箱 、 医 用 棉 签 、剪 刀 、 镊 子 、 一 次 性 注 射 器 、 酒 精 棉 、 碘 伏 棉 、 酒 精 灯 、 封 口 袋 、 标 签 纸 、 记 号 笔 、 记 录 表 格 等 。7.1.3 样 品 暂 存 运 输 装 备 ： 包 括 保 温 箱 、 冰 盒 或 液 氮 容 器 、 吸 水 填 充 材 料 、 包 装 胶 带
23、 、 警 示 标 识 等 。7.1.4 样 品 保 存 装 备 ： 冰 箱 （ 4 、 20 ） 、 液 氮 罐 等 。7.1.5 保 定 用 品 ： 包 括 操 作 笼 、 防 咬 嘴 套 、 眼 罩 和 麻 醉 药 物 （ 如 氯 胺 酮 注 射 液 ） 或 镇 静 药 物 （ 如 舒 泰 ） 。7.2 实 验 材 料酒 精 棉 球 、 厌 氧 试 管 （ 含 硫 代 乙 醇 酸 钠 等 还 原 剂 ） 、 厌 氧 肉 肝 汤 培 养 基 （ 或 BHI培 养 基 ） 、 SPS 琼脂 、 TSC 琼 脂 、 CW琼 脂 、 含 0.02 %叠 氮 钠 的 绵 羊 血 琼 脂 、 梭 菌
24、增 菌 培 养 基 、 含 铁 牛 乳 培 养 基 、 革 兰 染 色 液 、 雪 -浮 （ Schaeffer-Fulton） 染 色 液 ； 细 菌 生 化 鉴 定 管 ； Taq DNA聚 合 酶 、 胶 回 收 试 剂 盒 、 质 粒 提取 试 剂 盒 、 T载 体 （ 如 pMD18-T或 pMD19-T） 、 感 受 态 大 肠 杆 菌 细 胞 （ DH-5菌 株 ） ； 毒 素 分 型 血 清 、小 鼠 、 产 气 荚 膜 梭 菌 毒 素 基 因 和 16S rRNA基 因 特 异 性 引 物 （ 见 附 录 A.1） 、 PCR扩 增 试 剂 （ 见 附 录 A.2） 。7.3
25、 实 验 设 备厌 氧 罐 （ 或 厌 氧 培 养 箱 ） 、 低 温 冰 箱 、 80 冰 箱 、 保 温 箱 、 试 管 、 离 心 管 、 离 心 机 、 一 次 性 过 滤器 （ 滤 膜 孔 径 0.22 m） 、 光 学 显 微 镜 、 恒 温 摇 床 、 水 浴 锅 、 微 量 移 液 器 、 PCR仪 、 电 泳 仪 、 照 胶 仪 等 。8 样 品8.1 采 样 要 求8.1.1 采 样 人 员 应 为 兽 医 或 动 物 保 护 相 关 的 专 业 技 术 人 员 。 8.1.2 开 展 采 样 工 作 前 ， 应 了 解 、 掌 握 采 样 区 域 内 滇 金 丝 猴 的
26、种 群 数 量 、 活 动 规 律 、 生 活 习 性 及 保 定方 法 ， 制 定 样 品 采 集 、 运 输 和 保 存 等 完 整 的 技 术 方 案 ， 并 办 理 样 品 采 集 和 运 输 相 关 手 续 ， 确 保 采 样 过 程的 科 学 性 、 安 全 性 以 及 样 品 的 可 溯 源 性 。 样 品 可 采 集 动 物 园 或 饲 养 基 地 圈 养 的 滇 金 丝 猴 ， 但 应 得 到 相 应主 管 部 门 的 许 可 。 DB53/T 1059.1 2021 4 8.1.3 采 样 安 全 与 防 护 。 采 样 人 员 应 规 范 穿 戴 全 套 个 人 卫 生
27、安 全 防 护 装 备 做 好 自 我 防 护 。 与 样 品 直 接接 触 的 器 具 均 应 提 前 做 灭 菌 处 理 以 防 样 品 被 污 染 。 应 准 备 垃 圾 袋 带 回 采 样 过 程 中 产 生 的 所 有 废 弃 物 品 ，防 止 环 境 污 染 和 造 成 疫 病 传 播 。8.1.4 采 样 完 成 后 ， 所 使 用 的 器 械 、 容 器 、 个 人 防 护 用 品 等 均 要 进 行 无 害 化 处 理 。8.2 采 样 程 序8.2.1 采 集 滇 金 丝 猴 粪 便 时 选 取 新 鲜 （ 未 干 涸 变 色 变 形 ） 粪 便 ， 同 一 堆 粪 便 只
28、 采 集 一 份 样 品 （ 可 分 装于 多 只 采 集 管 ） ， 采 集 粪 便 内 部 部 分 。8.2.2 采 集 粪 便 时 用 棉 签 蘸 取 粪 便 放 入 对 应 采 集 管 中 ， 每 采 集 一 份 样 品 更 换 一 个 棉 签 ， 并 做 好 样 品 标记 和 采 样 记 录 。 记 录 表 包 括 样 品 编 号 、 采 集 管 数 、 种 群 、 采 集 地 名 、 采 集 日 期 、 采 集 人 、 粪 样 新 鲜 程 度 、生 境 状 况 等 采 样 信 息 。 粪 便 样 品 采 集 应 填 写 滇 金 丝 猴 采 样 记 录 表 （ 见 附 录 B 中 表
29、 B.1） 。8.3 样 品 保 存 与 运 输 8.3.1 粪 便 置 于 无 菌 的 螺 盖 厌 氧 试 管 或 含 硫 代 乙 醇 酸 钠 的 封 口 塑 料 袋 中 保 存 。8.3.2 采 集 或 处 理 的 样 品 在 4 条 件 下 保 存 不 超 过 24 h； 若 长 期 保 存 ， 应 置 于 80 冰 箱 。8.3.3 样 品 应 放 入 预 先 加 入 冰 袋 的 保 温 箱 内 并 及 时 送 实 验 室 检 查 。9 试 验 步 骤9.1 细 菌 分 离 培 养 及 培 养 特 性 观 察9.1.1 将 所 采 每 份 样 品 振 荡 混 匀 ， 接 种 于 厌 氧
30、 肉 肝 汤 培 养 基 中 ， 37 厌 氧 培 养 18 h 24 h。9.1.2 用 接 种 环 蘸 取 少 量 菌 液 涂 布 于 SPS 平 板 、 TSC 平 板 、 CW 平 板 （ 需 加 约 10%卵 黄 液 ） 和 绵 羊 血琼 脂 平 板 ， 置 于 厌 氧 罐 （ 箱 ） ， 37 厌 氧 培 养 18 h 24 h； 在 含 铁 牛 乳 培 养 基 （ 装 于 试 管 内 ） 于 46 厌 氧 培 养 2 h 5 h， 观 察 细 菌 生 长 情 况 。9.1.3 把 平 板 上 形 成 有 明 显 溶 血 环 的 单 菌 落 挑 取 加 入 梭 菌 增 菌 培 养
31、基 中 厌 氧 培 养 24 h， 获 得 分 离 菌 株 ， 用 于 进 一 步 的 鉴 定 。9.2 革 兰 染 色 和 芽 孢 染 色 镜 检取 细 菌 纯 培 养 物 或 粪 样 做 革 兰 染 色 和 雪 -浮 染 色 （ 见 附 录 C） ， 镜 检 细 菌 个 体 及 芽 孢 形 态 。9.3 细 菌 生 化 试 验按 生 化 鉴 定 管 说 明 书 操 作 ， 将 9.1.3 培 养 得 到 的 菌 液 接 种 于 分 别 含 酪 蛋 白 、 卵 磷 脂 酶 、 吲 哚 、 脂 酶 、葡 萄 糖 、 甘 露 糖 、 麦 芽 糖 、 乳 糖 、 硝 酸 盐 、 明 胶 和 水 杨
32、 苷 的 生 化 鉴 定 管 ， 观 察 细 菌 生 长 及 发 酵 情 况 。9.4 小 鼠 接 种 试 验9.4.1 小 鼠 毒 性 试 验将 产 气 荚 膜 梭 菌 分 离 菌 株 接 种 于 绵 羊 血 平 板 ， 37 厌 氧 培 养 24 h后 挑 取 具 有 典 型 溶 血 环 的 单 菌 落 ， 转 接 至 厌 氧 肉 肝 汤 培 养 基 中 厌 氧 培 养 14 h 16 h。 按 照 5%的 体 积 比 转 接 到 厌 氧 肉 肝 汤 培 养 基 或 BHI培 养基 ， 于 43 厌 氧 振 荡 （ 250 r/min） 培 养 6 h， 12 000 r/min离 心 1
33、5min取 上 清 ， 用 0.22 m滤 膜 过 滤 ， 获 得外 毒 素 。 取 外 毒 素 做 2倍 连 续 稀 释 ， 每 个 稀 释 度 接 种 一 组 实 验 小 鼠 ， 5只 实 验 小 鼠 为 一 组 ， 每 只 腹 腔 内 注射 0.3 mL。 对 照 组 小 鼠 腹 腔 内 注 射 经 60 /30 min处 理 的 滤 过 上 清 。 连 续 观 察 48 h， 记 录 小 鼠 发 病 及 死 亡情 况 。 DB53/T 1059.1 2021 5 9.4.2 毒 素 中 和 试 验在 灭 菌 试 管 内 ， 用 已 知 、 、 和 毒 素 特 异 性 的 抗 毒 素 （
34、 毒 素 分 型 血 清 ） ， 分 别 与 未 经 加 热 处 理 的产 气 荚 膜 梭 菌 培 养 物 上 清 轻 轻 搅 拌 混 合 ， 放 置 于 室 温 孵 育 30min， 再 腹 腔 注 射 5 只 实 验 小 鼠 。9.5 16S rRNA基 因 与 4种 毒 素 基 因 的 PCR扩 增 及 测 序 分 析9.5.1 细 菌 基 因 组 DNA 提 取按 照 细 菌 DNA提 取 试 剂 盒 说 明 书 提 取 产 气 荚 膜 梭 菌 基 因 组 （ 包 括 染 色 体 和 质 粒 ） DNA， 保 存 于 20 冰 箱 备 用 。9.5.2 PCR扩 增16S rRNA 基
35、 因 PCR 扩 增 体 系 见 附 录 A.2， 扩 增 程 序 ： 95 预 变 性 5min， 95 变 性 30s， 54 退火 30s， 72 延 伸 45s， 进 行 35 个 变 性 -退 火 -延 伸 循 环 ， 然 后 再 72 延 伸 10min； 、 、 和 四 种 毒 素 基 因 （ cpa、 cpb、 etx 和 itx） 的 PCR 扩 增 程 序 ， 除 退 火 温 度 分 别 设 置 为 50 、 50 、 50 和 52 ，其 他 条 件 不 变 。9.5.3 凝 胶 电 泳 检 查用 天 平 称 取 0.3 g 琼 脂 糖 ， 加 入 到 100 mL 规 格 的 锥 形 瓶 中 ， 量 取 30 mL 1 TAE 加 入 其 中 ， 置 于 微波 炉 加 热 至 琼 脂 糖 完 全 融 化 ； 待 琼
