DB22 T 3224-2021 EGFR基因突变检测技术规范.pdf

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1、 ICS 11.020 CCS C 05 22 吉 林 省 地 方 标 准 DB22/T 3224 2021 EGFR基 因 突 变 检 测 PCR技 术 规 范 EGFR Mutation Detection PCR Technology Standard 2021 - 04 16发 布 2021 - 05 - 01实 施 吉 林 省 市 场 监 督 管 理 厅 发 布 DB22/T 3224 2021 I 前 言 本 文 件 按 照 GB/T 1.12020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起 草 。 请 注 意

2、 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。 本 文 件 由 吉 林 省 卫 生 健 康 委 员 会 提 出 并 归 口 。 本 文 件 起 草 单 位 ： 吉 林 大 学 本 文 件 主 要 起 草 人 ： 姜 艳 芳 、 何 佳 雪 、 张 鹏 、 刘 思 文 、 刘 勇 、 邹 红 雁 、 胡 馨 元 、 胡 欣 彤 。 DB22/T 3224 2021 1 EGFR基 因 突 变 检 测 PCR技 术 规 范 1 范 围 本 文 件 规 定 了 EGFR基 因 突 变 检 测 的 样 本 要 求

3、 、 检 测 方 法 、 生 物 安 全 要 求 、 材 料 与 试 剂 、 数 据 处 理 、 结 果 判 定 、 废 弃 物 处 理 与 防 止 污 染 的 措 施 。 本 文 件 适 用 于 荧 光 PCR法 检 测 组 织 样 本 中 EGFR基 因 特 定 突 变 。 2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最

4、新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。 GB/T 6682 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法 GB 19489 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求 SN/T 1193 基 因 检 验 实 验 室 技 术 要 求 3 术 语 和 定 义 本 文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义 。 4 缩 略 语 下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件 。 EGFR 表 皮 生 长 因 子 受 体 （ Epidermal Growth Factor Receptor） ctDNA 循 环 肿 瘤 脱 氧 核 糖 核 酸

5、（ Circulating Tumor Deoxyribo Nucleic Acid） FFPE 福 尔 马 林 固 定 石 蜡 包 埋 组 织 （ Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded） NTC 无 模 板 对 照 （ No Template Control） 5 生 物 安 全 要 求 采 样 及 检 测 过 程 所 涉 及 的 实 验 操 作 应 按 GB 19489规 定 执 行 。 6 材 料 与 试 剂 仪 器 与 耗 材 6.1 6.1.1 II级 生 物 安 全 柜 。 6.1.2 涡 旋 混 合 仪 。 6.1.3 恒 温 加 热 器 （

6、56 90 可 调 ） 。 6.1.4 恒 温 水 浴 锅 （ 可 达 60 ） 。 DB22/T 3224 2021 2 6.1.5 微 量 移 液 器 ： 10 L、 100 L、 200 L、 1000 L 。 6.1.6 微 量 带 滤 芯 吸 头 ： 10 L、 100 L、 200 L、 1000 L。 6.1.7 医 用 冰 箱 ： 2 8 、 -20 、 -80 。 6.1.8 离 心 机 ： 10 mL转 子 ， 转 速 不 低 于 10000 g/min， 可 低 温 离 心 。 6.1.9 离 心 机 ： 1.5 mL转 子 ， 转 速 不 低 于 13000 g/min

7、， 可 低 温 离 心 。 6.1.10 实 时 荧 光 定 量 PCR仪 。 6.1.11 离 心 管 ： 200 L、 1.5 mL、 2 mL、 10 mL、 15 mL。 试 剂 6.2 6.2.1 除 另 有 规 定 ， 本 方 法 试 验 用 水 应 符 合 GB/T 6682规 定 的 二 级 水 ， 所 用 化 学 试 剂 均 为 分 析 纯 。 6.2.2 核 酸 提 取 试 剂 。 6.2.3 荧 光 PCR 试 剂 。 6.2.4 无 水 乙 醇 。 6.2.5 异 丙 醇 。 6.2.6 二 甲 苯 。 6.2.7 RNase A。 6.2.8 TE缓 冲 液 。 7

8、样 本 采 集 7.1 7.1.1 组 织 样 本 石 蜡 包 埋 病 理 组 织 或 切 片 样 品 应 确 定 含 有 肿 瘤 病 变 细 胞 ， 将 石 蜡 包 埋 病 理 组 织 或 切 片 样 品 切 成 厚 度 为 5 m的 切 片 ， FFPE 样 本 的 组 织 面 积 应 介 于 0.5 cm2 1 cm2， 切 片 用 量 为 5 片 。 7.1.2 外 周 血 样 本 10 mL， 使 用 streck管 采 集 ， 不 可 使 用 肝 素 抗 凝 剂 。 7.1.3 记 录 样 本 接 收 记 录 表 参 见 附 录 A。 保 存 与 运 输 7.2 7.2.1 FFP

9、E样 本 保 存 在 2 8 低 温 运 输 ， 最 长 可 以 保 存 3 年 。 7.2.2 streck 管 血 液 样 本 避 光 常 温 运 输 ， 忌 暴 晒 、 冷 冻 ， 在 室 温 下 最 多 可 以 保 存 3 d。 8 检 测 在 试 剂 准 备 间 生 物 安 全 柜 内 进 行 以 下 操 作 ： 8.1 a) 根 据 样 本 类 型 ， 按 照 样 本 数 +2（ 阳 性 和 阴 性 对 照 品 各 一 ） 配 制 反 应 体 系 ； b) 将 配 好 的 PCR体 系 转 移 至 样 本 制 备 间 ； 在 样 本 制 备 间 生 物 安 全 柜 内 进 行 以

10、下 操 作 ： 8.2 DB22/T 3224 2021 3 a) 组 织 样 本 ： 刮 取 5片 FFPE样 品 至 1.5 mL离 心 管 中 ， 通 过 脱 蜡 、 去 除 RNA、 柱 提 法 等 步 骤 提 取 DNA并 进 行 洗 脱 及 纯 化 ， 获 得 可 用 于 荧 光 PCR反 应 的 待 检 DNA， 待 检 的 样 品 的 DNA浓 度 为 1.5 3 ng/L； b) 血 液 样 本 通 过 进 行 离 心 、 去 除 RNA、 柱 提 法 等 步 骤 提 取 ctDNA并 进 行 洗 脱 及 纯 化 ， 获 得 可 用 于 荧 光 PCR反 应 的 待 检 ct

11、DNA； c) 根 据 样 本 类 型 ， 将 适 量 已 提 取 的 DNA 与 PCR反 应 体 系 进 行 混 合 ； 同 时 设 置 NTC阴 性 和 阳 性 对 照 ； 在 扩 增 间 进 行 如 下 操 作 ： 8.3 a) 实 时 荧 光 定 量 PCR仪 中 进 行 PCR反 应 ， 组 织 样 本 检 测 参 数 见 表 1。 表 1 组 织 样 本 荧 光 PCR 参 数 步 骤 温 度 时 间 循 环 数 1 95 5 min 1 2 95 25 s 15 64 20 s 72 20 s 3 93 25 s 31 60 35 s 72 20 s b) 实 时 荧 光 定

12、量 PCR仪 中 进 行 PCR反 应 ， 血 液 样 本 检 测 参 数 见 表 2。 表 2 血 液 样 本 荧 光 PCR 参 数 步 骤 温 度 时 间 循 环 数 1 95 10 min 1 2 95 40 s 15 64 40 s 72 30 s 3 93 40 s 28 60 45 s 72 30 s DB22/T 3224 2021 4 9 数 据 处 理 检 测 完 成 后 ， 计 算 机 自 动 进 行 数 据 分 析 。 10 阴 阳 性 对 照 实 验 室 对 照 品 10.1 10.1.1 阳 性 对 照 品 为 临 床 阳 性 样 本 合 成 的 质 粒 DNA与

13、血 浆 DNA混 合 样 本 ； 阴 性 对 照 品 为 超 纯 水 。 10.1.2 阳 性 对 照 品 检 测 结 果 为 阳 性 ； 阴 性 对 照 品 检 测 结 果 为 阴 性 。 内 标 基 因 10.2 检 测 试 剂 应 自 带 内 标 基 因 ， 以 确 认 PCR检 测 是 否 正 确 运 行 。 11 结 果 判 定 当 检 测 指 标 值 大 于 该 指 标 阳 性 判 断 值 时 ， 判 定 为 阴 性 。 11.1 当 检 测 指 标 值 小 于 或 等 于 该 指 标 阳 性 判 断 值 时 ， 判 定 为 阳 性 。 11.2 组 织 样 本 各 指 标 阳 性

14、 判 断 值 见 表 3。 11.3 表 3 组 织 样 本 各 指 标 的 阳 性 判 断 值 指 标 名 称 检 测 内 容 阳 性 判 断 值 19-Del E746_A750del(1) E746_A750del(2) L747_P753S E746_T751I E746_T751del E746_T751A E746_ S752A E746_ S752V E746_ S752D L747_A750P L747_T751Q L747_E749del L747_T751del L747_ S752del L747_A750P L747_P753Q L747_T751S L747_T751

15、del L747_T751P 26或 Ct Cut-off值 11 L858R L858R 26或 Ct Cut-off值 11 T790M T790M 26或 Ct Cut-off值 7 20-Ins H773_V774insH V769_D770insASV D770_N771insG 26或 Ct Cut-off值 9 G719X G719A/ G719 S/G719C 26或 Ct Cut-off值 7 S768I S768I 26或 Ct Cut-off值 8 L861Q L861Q 26或 Ct Cut-off值 8 DB22/T 3224 2021 5 血 液 样 本 各 指 标

16、 阳 性 判 断 值 见 表 4。 11.4 表 4 血 液 样 本 各 指 标 的 阳 性 判 断 值 指 标 名 称 检 测 内 容 阳 性 判 断 值 19-del E746_A750del(1) E746_A750del(2) L747_P753S E746_T751I E746_T751del E746_T751A E746_ S752A E746_ S752V E746_ S752D L747_A750P L747_ S752Q E746_T751T L747_K754QL L747_ S752Q E746_K754EQHL L747_T751Q L747_E749del L747

17、_T751del L747_ S752del L747_A750P L747_P753Q L747_T751 S L747_T751del L747_T751P L747_T751del E746_T751V L747_A750P E746_A750QP E746_T751Q Ct值 FAM - Ct值 HEX 11 T790M T790M Ct值 FAM - Ct值 HEX 8 G719A/ G719 S/G719C G719A/ G719 S/G719C Ct值 FAM - Ct值 HEX 12 20-ins H773_V774insH V769_D770insASV V769_D770i

18、nsASV D770_N771insG D770_N771insSVD H773_V774insNPH Ct值 FAM - Ct值 HEX 11 L858R L858R Ct值 ROX- Ct值 HEX 11 L861Q L861Q Ct值 ROX- Ct值 HEX 12 S768I S768I Ct值 CY5 - Ct值 HEX 12 12 废 弃 物 处 理 和 防 止 污 染 的 措 施 废 弃 物 应 经 121 高 压 灭 菌 30 min后 再 弃 置 。 12.1 实 验 室 废 弃 物 处 理 和 防 止 污 染 的 措 施 应 按 SN/T 1193的 规 定 执 行 。 DB22/T 3224 2021 6 A A 附 录 A （ 资 料 性 ） 样 本 接 收 记 录 表 样 本 接 收 记 录 表 见 表 A.1。 表 A.1 样 本 接 收 记 录 表 序 号 姓 名 开 单 科 室 住 院 号 /门 诊 号 检 测 项 目 条 码 号 接 收 日 期 样 本类 型 样 本 状 态 送 样 人 实 验 室接 收 人 正 常_ 正 常_ 正 常_ 正 常_ 正 常_ 正 常_ 正 常_ 正 常_ 正 常_ 正 常_ 正 常_ 正 常_ 正 常_ 正 常_ 正 常_ 正 常_ 正 常_ 正 常_