SN T 5333-2020 玉米霜霉病菌（非中国种）检疫鉴定方法.pdf

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1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5333 2020 玉米霜霉病菌（非中国种） 检疫鉴定方法 RDetection and identification of Peronosclerospora spp. (non-Chinese) 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5333 2020 I 前 言 本文件按照 GB/T1.12020 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这

2、些专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、长沙海关技术中心、河口海关。 本文件起草人：吴品珊、罗志萍、雷荣、段禄华、陈岩。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5333 2020 玉米霜霉病菌（非中国种） 检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了爪哇霜霉病菌、菲律宾霜霉病菌、甘蔗霜霉病菌和高粱霜霉病菌 4 种玉米霜霉病菌 非中国种的检疫鉴定方法。 本文件适用于玉米、高粱和甘蔗等禾本科植物的植株及种子中玉米霜霉病菌（非中国种）的检疫 和鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定

3、的术语和定义。 4 病菌的基本信息 学名： Peronosclerospora spp. 分类地位：藻菌界 Chromista，卵菌门 Oomycota ，霜霉纲 Peronosporea ，霜霉目 Peronosporales， 霜霉科 Peronosporaceae ，霜指霉属 Peronosclerospora 。 玉米霜霉病菌（非中国种）指霜指霉属（ Peronosclerospora）中的爪哇霜霉病菌（ P. maydis）、 菲 律宾霜霉病菌（ P. philippinensis）、甘蔗霜霉病菌（ P. sacchari）和高粱霜霉病菌（ P. sorghi），它们专 性寄生于玉米

4、、高粱和甘蔗等禾本科植物上，在热带和亚热带危害严重。 传播途径：病菌主要在野生寄主上越冬，翌年侵染玉米等寄主作物。病菌近距离传播主要靠染病 叶片上的分生孢子或卵孢子，远距离传播主要靠寄主植物插条、高粱种子、种子中夹带的病残体或新 鲜湿润的种子。 玉米霜霉病菌（非中国种）的其它信息参见附录 A。 5 方法原理 根据玉米霜霉病菌（非中国种）4 种病原菌的形态学特征和分子生物学特性，利用通用引物和特 异性引物进行 PCR 扩增并测序比对的原理，对病菌进行综合检疫鉴定。 6 仪器设备和主要试剂 6.1 仪器设备 生物显微镜（具测量功能），体视显微镜，超净工作台，天平，高压灭菌锅，台式高速离心机， 以正

5、式出版文本为准 2 SN/T 5333 2020 pH 计，低温冰箱、常规冰箱、水浴箱， PCR 扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪。 6.2 主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。席尔氏浮载剂，乳酚油，氢氧化钠，苯胺蓝，PCR缓冲液、 dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、 Taq DNA 聚合酶，dNTPs，通用引物 ITS5/ ITS4，特异性引物引 物 Pssm -2/Pssm-3 和特异性引物 Pmly -1/Pmly-2。 7 检疫鉴定方法 7.1 症状检查 4 种病菌在寄主植株上引致的症状近似。观察玉米、甘蔗和高粱叶片是否有褪绿色条斑，叶基部 是否变黄，叶背面是否

6、有白色霉层（参见附录 A）。 检查挑取瘦小、霉变、畸形的种子，以及种子中夹带的病残体、高粱颖壳，观察是否有病斑， 病斑是否有霉层。 7.2 形态学鉴定 对于有霉层的病斑，直接挑取病菌分生孢子囊和孢囊梗制片镜检，或用小块透明胶带粘取霉层 制片镜检。观测记录分生孢子囊和孢囊梗的形状、大小，分生孢子囊至少测量 30 个。 7.3 组织透明检测 取病残体、种皮、种子的颖壳，在 10% 氢氧化钠中煮沸透明 1020min，苯胺蓝染色、镜检，观 察菌丝形态和卵孢子。 7.4 分子生物学鉴定 7.4.1 DNA 提取 对于有霉层的病组织，直接搜集病菌提取 DNA ；对于无霉层的病组织，取病变部位用液氮研磨，

7、 然后提取 DNA。 按 CTAB 方法提取 DNA 参见附录 B。 7.4.2 PCR 反应及序列比对 对于病菌DNA，利用真菌通用引物ITS5（5 -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3） 和 ITS4 （5 -TCCTCCGCT- TATTGATATGC-3）进行扩增，然后测序。 对于病组织的 DNA，用特异性引物引物 Pssm -2/Pssm-3（Pssm -2 ：5 -GTGAAGGCTAGCGGCTT-3， Pssm- 3 ：5 -AGAGACTTTCGTCCCCACAG- 3 ） 或 Pmly - 1/Pmly- 2（Pmly - 1 ：5 - GGATGTCTGCG

8、ATCATCGATTTGAA-3，Pmly -2 ：5 -ATCCAGGAGACTTTTCCAACTTAAT-3）进行扩 增，然后测序。 PCR 反应程序参见附录 C。 将获得的序列与NCBI网站Genbank中公开发表的 Peronosclerospora maydis、 Peronosclerospora philippinensis、 Peronosclerospora sacchari 和 Peronosclerospora sorghi 的序列进行相似性比对分析。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5333 2020 8 鉴定特征 8.1 症状特征 玉米受侵染后全株呈淡绿色，逐渐变为

9、黄色或浅黄色，直至枯死。成株受害，多自中部叶片的基 部开始发病，叶基部褪绿或产生退绿条斑，逐渐向上蔓延，形成淡黄至白色条斑、黄绿相间的条纹， 严重时叶片全部失绿。潮湿情况下，叶背面可见病菌霉层。 甘蔗病株矮化、茎细小，叶窄直立，叶条纹颜色绿黄或黄，逐渐变为红褐色或深红色。 高粱病株叶片窄、较为直立，叶基部黄化，直至整个叶片出现黄白色长条纹，潮湿时在叶片黄 化部位的上下表现均可出现白色霉层。 8.2 形态学特征 Peronosclerospora maydis ：菌丝体无色多核，菌丝有不同形状的吸器。孢囊梗自气孔伸出，无色， 基部细，有一隔膜，上部肥大，双分叉 24 次，整体呈圆锥形，梗长 15

10、0550 m，小梗近圆锥形弯 曲，顶生一个分生孢子囊。分生孢子囊无色，长椭圆形至近球形，大小为 1626 m1520 m，萌发 生芽管。未发现卵孢子。 Peronosclerospora philippinensis ：菌丝体无色多核，不规则收缩与膨大，吸器简单，泡囊状至近指 状，28 m。孢囊梗自气孔伸出，无色，长150400 m，双分枝24次，分枝粗壮，小梗锥形，稍弯， 长 10 m。分生孢子囊无色，长卵形至圆柱形，顶端稍圆，大小为 2739 m1721 m，萌发生芽管。 卵孢子罕见，球形，壁光滑，直径 15.322.6 m。 Peronosclerospora sacchari ：菌丝体

11、无色多核。孢子囊单个或成双从气孔伸出，无色直立，长 160170m，基部略细，宽 1015 m，有足细胞，向上渐粗约为基部的23倍，02隔膜，上 部双分枝23次。分生孢子囊无色，椭圆、长椭圆或长卵形，顶端圆，基部稍尖或圆，大小 为 2541 m1523 m，萌发生芽管。卵孢子黄色，球形或稍呈多角形，直径4050 m，壁厚 3.85m。 Peronosclerospora sorghi ：菌丝体无色多核。孢囊梗直立，无色，长为 180300 m，有足细胞，顶 端二叉分枝 13 次，分枝粗短常排列成半球形，小梗尖，顶生一个分生孢子囊。分生孢子囊近圆形， 大小为 1526.9 m1528.9 m，萌

12、发生芽管。卵孢子无色球形，大小为 2542.9 m，平均 36 m，具 有淡黄色外壁。 病菌形态图和 4 个近似种的形态比较参见附录 A。 8.3 序列对和 PCR 特异性产物 通用引物 PCR 扩增片段大小约为 442bp，测序结果与 NCBI 网站 Genbank 中 Peronosclerospora maydis、 Peronosclerospora philippinensis、 Peronosclerospora sacchari和 Peronosclerospora sorghi的序列比对， 相似性应为 98% 以上。 特异性引物 Pssm-2/ Pssm-3 扩增出的目标片段大

13、小为 120bp 左右；引物 Pmly-1/Pmly-2 扩 增的目标片段大小为 200bp 左右。测序结果与 NCBI 网站 Genbank 中 Peronosclerospora maydis、 Peronosclerospora philippinensis、 Peronosclerospora sacchari 和 Peronosclerospora sorghi 的序列比对，相似 性应为 98% 以上。 9 结果判定 寄主植株的症状和病菌形态与 8.1 和 8.2 描述的一致，且通用引物 PCR 扩增 ITS 基因的测序比 以正式出版文本为准 4 SN/T 5333 2020 对结果

14、与 Genbank 数据库中 4 种玉米霜霉病菌中的任何 1 种基因序列性超过 98% 即可视为同一种 真菌。 病残体和种子颖壳或种皮中的病菌与 8.2 描述的一致，且特异性引物 PCR 扩增的测序比对结果 与Genbank数据库中4种玉米霜霉病菌中的任何1种基因序列相似性超过98%即可视为同一种真菌。 10 样品保存和记录 10.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出玉米霜霉病菌（非中国种）的样品应保存于 4 冰 箱中，以备复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。 10.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和

15、结果等，并要有 实验人员和审核人员签字。病菌需有显微形态照片，PCR 凝胶电泳检测需有电泳结果照片。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5333 2020 A 附 录 A （资料性） 玉米霜霉病菌（非中国种）的相关资料 A.1 爪哇霜霉病菌 学名： Peronosclerospora maydis（Racib.）Shaw 异名： Peronospora maydis Racib.， Sclerospora maydis （Racib.）Butl， Sclerospora jaanica Palm 英文名：Java downy mildew 分布：印度尼西亚、印度、以色列、日本、泰国、刚果（金）

16、、澳大利亚、牙买加、委内瑞拉。 寄主植物：玉米 Zea mays L.、羽高梁 Sorghum plumosum、墨西哥假蜀黍 Euchlaena mexicana、狼 尾草属 Pennisetum、摩擦禾属 Tripsacum。 传播途径：菌丝体不耐干燥，在干燥的种子中会失去活力。新鲜湿润的寄主种子、种子中夹带的 病残体是病菌远距离传播的途径。 图 A.1爪哇霜霉病菌形态图 注：图自 中国真菌志 第六卷霜霉目，1. 孢囊梗；2. 孢子囊；3. 孢子囊萌发。 A.2 菲律宾霜霉病菌 学名： Peronosclerospora philippinensis （W.West）C. G. Shaw

17、异名： Sclerospora maydis Reinking， Sclerospora philippinensis W.Weston 英文名：Philippine downy mildew 分布：菲律宾、泰国、印度、印度尼西亚、尼泊尔、日本、巴基斯坦、毛里求斯。 寄主植物：玉米 Zea mays L.、甘蔗属 Saccharum L.、高梁属 Sorghum Moench、燕麦 Avena sativa L.、 须芒草属 Andropogon、孔颖草属 Bothriochloa、假蜀黍属 Euchlaena、金茅属 Eulalia、芒属 Miscanthus、 裂稃草属 Schizachy

18、rium、摩擦禾属 Tripsacum。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5333 2020 图A .2 菲律宾霜霉病菌形态图 注： 图自中国真菌志第六卷霜霉目， 1. 孢囊梗； 2. 孢子囊； 3. 孢子囊萌发。 传播途径：分生孢子囊借风雨传播做近距离传播。病菌可存活在含水量为 36%-38% 的种子中， 种子含水量低于 14% 时种子不传病。甘蔗插条、新鲜湿润的寄主种子、种子中夹带的病残体是病菌 远距离传播的途径。 A.3 甘蔗霜霉病菌 学名： Peronosclerospora sacchari（T. Miyake) Shirai & Hara 异名： Peronosclerospor

19、a sacchari (T. Miyake) C. G. Shaw， Sclerospora sacchari T. Miyake 英文名；Sugarcane downy mildew 分布：菲律宾、泰国、印度尼西亚、印度、尼泊尔、日本、越南、尼日利亚、巴布亚新几内亚、 斐济。 寄主植物：玉米 Zea mays L.、甘蔗属 Saccharum、高梁属 Sorghum、须芒草属 Andropogon、孔颖 草属 Bothriochloa、稗属 Echinochloa、蟋蟀草属 Eleusine、假蜀黍属 Euchlaena、金茅属 Eulalia、芒属 Miscanthus、黍属 Panicu

20、m、棒头草属 Polypogon、裂稃草属 Schizachyrium、狗尾草属 Setaria、摩擦禾 属 Tripsacum。 图A .3 甘蔗霜霉病菌形态图 注： 图自中国真菌志第六卷霜霉目，1. 孢囊梗；2. 孢子囊；3. 藏卵器与卵孢子；4. 吸器。 以正式出版文本为准 7 SN/T 5333 2020 传播途径：分生孢子囊借风雨传播做近距离传播。菌丝不耐干燥，种子含水量低于 20% 时种子 不传病，甘蔗插条、新鲜湿润的寄主种子、种子中夹带的病残体是病菌远距离传播的途径。 A.4 高梁霜霉病菌 学名： Peronosclerospora sorghi （Weston & Uppal）

21、C. G. Shaw 异名： Sclerospora sorghi W. Weston & Uppal， Sclerospora graminicola var.andropogonis-sorghi Kulk.， Sclerospora andropogonis-sorghi（Kulk.）Mundk. 英文名：Sorghum downy mildew 分布：泰国、菲律宾、尼泊尔、孟加拉、柬埔寨、越南、日本、印度、印度尼西亚、巴基斯坦、 伊朗、东帝汶、也门、以色列、埃及、加纳、尼日利亚、苏丹、埃塞俄比亚、索马里、肯尼亚、乌干 达、坦桑尼亚、赞比亚、马拉维、津巴布韦、博茨瓦纳、南非、贝宁、布基纳

22、法索、布隆迪、毛里求 斯、莫桑比克、尼日利亚、卢旺达、苏丹、斯威士兰、澳大利亚、美国、墨西哥、尼加拉瓜、波多黎 各（美）、危地马拉、萨尔瓦多、洪都拉斯、巴拿马、哥伦比亚、委内瑞拉、秘鲁、巴西、玻利维亚、 阿根延、乌拉圭。 寄主植物：玉米 Zea mays L.、高梁 Sorghum vulgare Pers.、 Sorghum bicolor 、 Sorghum caffrorum、 苏丹草 Sorghum sudanense、约翰逊草 Sorghum halepense、须芒草属 Andropogon、双花草属 Dichanthium、假蜀黍属 Echlaena、黄芽属 Heteropogo

23、n、黍属 Panicum、狼尾草属 Pennisetum、菅草 属 Themeda。 图A .4 高粱霜霉病菌形态图 注：图自中国真菌志第六卷霜霉目， 1. 孢囊梗； 2. 孢子囊； 3. 藏卵器与卵孢子。 传播途径：玉米上很少产生卵孢子，玉米病株种子的果皮与果梗中有菌丝，但当种子含水量降 至9%，并贮存40天则菌丝死亡。高梁叶片的褐色条斑中大量产生卵孢子，卵孢子也能在高梁种子 和种子的颖苞中产生，因此病菌远距离传播的途径是新鲜湿润的寄主种子、高粱种子、高梁种子颖壳 和病残体。 以正式出版文本为准 8 SN/T 5333 2020 附表 A.1 玉米霜霉病菌（非中国种）形态比较 学名 中文名

24、主要寄主 孢子囊 卵孢子 Peronosclerospora maydis 爪哇霜霉 玉米 1626m1520 m 无 Peronosclerospora philippinensis 菲律宾霜霉 玉米、甘蔗、高粱 2739m1721 m 15.322.6m Peronosclerospora sacchari 甘蔗霜霉 玉米、甘蔗、高粱 2541m1523 m 4050m Peronosclerospora sorghi 高粱霜霉 玉米、高粱 1526.9m1528.9 m 2542.9m 以正式出版文本为准 9 SN/T 5333 2020 附 录 B （资料性） DNA 提取方法 将搜集

25、的病菌或液氮研磨后的植物组织放入离心管中，加入 300-500 L CTAB 缓冲液（其中含 0.1g蛋白酶K）混匀，65水浴1h；13000g离心510min，保留上清液；加 500 L Tris饱和酚氯仿 异戊醇（体积为 25 24 1）混匀，13000g 离心 510min，保留上清液；再加 500 L 氯仿 : 异戊醇（体 积为 24 1）混匀，13000g 离心 510min，保留上清液；加入 1mL 异丙醇混匀，-70下放置 1h， 或 -20过夜；13000g 离心 30min，可见 DNA 沉淀；70% 乙醇洗 DNA 沉淀，室温干燥；用 3050 L Tris-EDTA 缓冲

26、液溶解 DNA，待用。 以正式出版文本为准 10 SN/T 5333 2020 附 录 C （资料性） PCR 反应程序 25L 反应体系中含：样品 DNA 1 L（150ng），10PCR buffer 2.5 L，25mM MgCL2 2 L，2.5mM dNTps 2L，10 M Primers 各 0.5 L，5U/ L Taq DNA poLymerase 0.2L，ddH2O 16.3 L。同时要设置阴 性对照，以 Tris -EDTA 缓冲液代替 DNA 样品。 PCR 反应条件为：预变性，94 4min 变性，95 1 min ，退火 56 30 s、72 45 s，35 个循

27、 环 72 10 min 4保存。 PCR 产物的检测在 1TAE 电泳缓冲液中，1.5% 琼脂糖凝胶电泳，5V/cm，0.5% EB 染色 20 min， 凝胶成像仪分析结果。如有目标片段大小的单带出现，将扩增产物进行序列测定。 以正式出版文本为准 11 SN/T 5333 2020 参考文献 1 Adenle V O. and Cardwell K F. Seed transmission of maize downy midew (Peronosclerospora sorghi) in Nigeria. Plant Pathology , 2000, 49: 628-634. 2 CA

28、B International, 2014. Crop Protection Compendium, 2014 Edition. Wallingford, UK: CAB International. www.cabicompendium.org/cpc 3 Williams R J. Downy mildews of tropical cereals, Advances in Plant Pathology, 1984, 2: 1-103. 4 王圆，吴品珊，姚成林，等 . 广西云南玉米霜霉病病原菌订正 J. 真菌学报，1994，01 ：1 -7. 5 余永年 . 中国真菌志：霜霉目 M. 北京：科学出版社，1998. 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1 字数 24 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1500 书号：1551752 定价 16.00 元 玉米霜霉病菌（非中国种） 检疫鉴定方法 行 业 标 准 SN/T 53332020 * * * SN/T 5333 2020 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址