HG T 3617-1999 苏云金杆菌可湿性粉剂.pdf

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1、HG 3617-1999 前主同本标准是根据我国以往制定的苏云金杆菌企业标准等有关材料，结合我国实际情况而制定的。本标准对苏云金杆菌可湿性粉剂的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从而为苏云金杆菌的生产提供了统一的技术依据。本标准由中华人民共和国原化学工业部技术监督司提出。本标准由化学工业部沈阳化工研究院归口。本标准主要起草单位z中国农业大学应用化学系本标准参加起草单位g湖北省生物农药工程研究开发中心、济南科贝尔生物工程有限公司。本标准主要起草人:J丰茂、王开梅、钱传范、钟连胜、赵欣昕、王绪文。1166 中华人民共和国化工行业标准HG 3617 1999 苏云金杆性粉剂Ba

2、ciIJus thuringiensis weltable powder 苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis ,B. t. )是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴抱晶体中的毒素蛋白，其中，对鳞翅目有毒力的蛋白相对分子质量为13000001 范围本标准规定了苏云金轩菌可湿性粉剂的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运。本标准适用于由苏云金杆菌原药和助剂等制成的苏云金杆菌可湿性粉剂，主要用于防治鳞翅目害虫。2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用丽梅成为本标准的条文。本标准出版时，所有版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用

3、下列标准最新版本的可能性。GB/T 1250一1989极限数值的表示方法和判定方法GB/T 1600-1979(1989) 农药水分测定方法GB/T 1601-1993 农药pH值的测定方法GB/T 1604-1995 商品农药验收规则GB/T 1605-1979(1989) 商品农药采样方法GB 3796 1983 农药包装通则GB/T 5451-1984 农药可湿性粉剂湿润性测定方法GB/T 14825-1993 农药可湿性粉剂悬浮率测定方法GB/T 16150-1995 农药粉剂、可湿性精剂细度测定方法HG 3616-1999 苏云金杆菌原秘3 要求3. 1 外观z灰白色至棕褐色疏松粉末

4、，不应有团块。3.2 苏云金杆菌可湿性精剂应符合表1要求。表l苏云金杆菌可湿性粉剂控制项目指标指标项目320001V/mg 16000 IU/mg 毒章蛋白.Yo二注4.0 2.0 毒力效价(pxlU/mgJHa IU/mgJ) 二注32 000 16000 pH值6.0-7.5 细度(75m)，%二注98 国*石油和化学工业周1999-06-16批准8000 lU/mg 1. 0 8000 2006 -01实施1167 HG 3617-1999 表1(完)指标项目32 000 IU/mg 160001U!mg 8000lU/mg 悬浮率(有效成分).% 二三70 渥润时间，mln三三3 水分

5、.%飞产4. 0 注:PX和Ha分别为小菜峨CPlutellaxylostel1a)和棉铃虫CHeliothisarmigera)的缩写。4 试验方法除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液。4. 1 抽样按照GB/T16051979(1989)中第五章粉剂和可湿性粉剂的采样进行，用随机数表法确定抽样的包装件。最终抽样量应不少于100go 4.2 鉴别试验当用生物测定法检测产品质量产生疑问时，可用以下方法进行鉴定。用十二烧基硫酸饷聚丙烯酷胶凝胶电泳(SDS-PAGE)方法测定有效毒素蛋白的相对分子质量是否为130000.并同时测定毒素蛋白含量是否符合3.2指标的规定。4. 3

6、毒素蛋白含量的测定毒素蛋白含量可以用SDS-PAGE-扫描法和SDS-PAGE-洗脱比色法两种方法进行测定，二者精密度、准确度接近.前者由于自动化程度更高，而定为仲裁法。4.3.1 SDS-PAGE扫描法(仲裁法)4.3.1.1 方法提要用碱性溶液处理苏云金杆菌可湿性秘剂伴抱晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS-PAGE.依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，之后用薄层扫描仪或电泳图像扫描仪扫描蛋白区带面积，进行定量。4.3.1.2 仪器、设备电泳仪。夹芯式垂直电泳槽(1.5mm凹形带槽橡胶模框)、凝胶板面积145mmX100 mm(1. 5 mm、12孔样品槽模具)。高

7、速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪。离心机:10000 r/mino 分析天平:精确至O.000 1 g 0 4.3.1.3 试剂和溶液过硫酸镀(AP)。十二烧基硫酸销(SDS)。四甲基乙工胶(TEMED)。氮氧化锅。30%丙烯酷胶g称取丙烯酸胶30g.亚甲基双丙烯酌胶(原称2甲叉双丙烯戳胶)0.8 g.溶于100mL 蒸馆水中，过滤，于4C暗处贮存备用。1 mol/L, pH8. 8三经基甲基氨基甲烧-HCl缓冲液称取三资基氨基甲烧30.25 g溶于蒸饱水中，用浓盐酸调至pH8.8.用蒸馆水定容至250mL 1 mol/L、pH6.8三援基氨基甲烧HCl缓冲液2称取三经基氨基甲统12.10g溶

8、于蒸t菌水中，用浓1168 HG 3617-1999 盐酸调至pH6.8.用蒸馆水定容至100mL 电极缓冲液2称取三资基氨基甲烧3.03 g.甘氨酸14.42g.十二烧基硫酸锅1g.用蒸馆水溶解并定容至1000mL 3X样品稀释液:1 mol/L pH6. 8三经基氨基甲烧HCl18.75 mL.十二娩基硫酸锅6g.甘油30mL.疏基乙醇15mL.少许澳自由蓝，用蒸馆水定容至100mL。染色液g称取考马斯亮蓝(CBB)R-2501 g.加入甲醇450mL.冰乙酸1mL.蒸馆水450mL.溶解过滤后使用。脱色液2量取甲醇100mL.冰乙酸35mL.用蒸馆水定容至1000mL。漂洗液:量取元水乙

9、醇30mL.冰乙酸10mL.蒸馆水60mL.混合均匀后使用。毒素蛋白标样毒素蛋白(相对分子质量为130000)含量为9.3%的原粉。4. 3. 1.4 试样处理称取标样、试样各20mg(准确至0.1mg).移至5mL离心管中，加2mL水充分悬浮。然后加入0.55 mol/L氢氧化锅溶液。.45mL(使氢氧化铺溶液的终浓度为0.1mol/L).放置约5min，再加人3X样品稀释液1.30mL.使最终体积为3.75mL.于100C沸蒸馆水中煮6min，离心(2000r/min)10 mm后取上层清液，以备电泳上祥。4. 3. 1. 5 SDS-PAGE分离毒素蛋白a)制备8%-10%聚丙烯酷胶凝胶

10、采用不连续缓冲系统，制胶方法见HG3616-1999 附录A(提示的附录)。b)上样取上述标样溶解上层清液，于聚丙烯酷胶凝胶的上样孔中分别上样6、8、10、12、14L(毒素蛋白含量约为3-7g).作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液(毒素蛋白含量约为5月).加入到上样孔中，注人电极缓冲液后，接通电源。c)电泳电泳初期电压控制在100V左右，待试样进入分离胶后，加大电压到120V.继续电泳，当指示剂前沿到达距底端1cm左右时停止电泳，取出胶板，在7.5%(体积百分数乙酸中浸泡30mino d)染色将分离胶部分取下，用考马斯亮蓝(CBB)R-250染色液染色过夜。e)脱色倒去染色液，先用

11、漂洗液洗涤凝跤，然后加入脱色液，于37C下加热使其脱色，更换几次脱色液，直至背景清晰为止。4. 3. 1.6 测定胶板经脱色后，可清晰地看到130000蛋白区带，用高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪扫描该区带，扫描波长为600nmo 样品中毒素蛋白的百分含量(X)按式(1)进行计算。X 隅，V= . .: X 100 m2v 1 式中:ml一一从标准曲线上查得的祥品中毒素蛋白的量，g，m，一一2mL稀释液中样品的质量，mg;V1一一一样品最终定容体秧.mL(3.75 mL), V2 注人凝胶上样孔的样晶体秧，Lo4. 3. ,. 7 允许差取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于

12、等于8%。4.3.2 SDS-PAGE-洗脱比色法. ( 1 ) 1169 HG 3617-1999 4. 3. 2.1 方法提要用碱性溶液处理苏云金杆菌可湿性粉剂伴抱晶体，使其降解为毒素蛋白后，通过SDS-PAGE.依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，再割胶，洗脱，测定吸光度。4.3.2.2 仪器、设备分光光度汁。其他同4.3.1.2，4. 3. 2. 3 试剂和溶液毗呢。其他同4.3.1.3。4. 3. 2.4 试样处理同4.3.1.4，4.3.2.5 SDS-PAGE分离毒素蛋白a)制备8%10%聚丙烯酷胶凝胶同4.3.1.5a)。b)上样取上述标样溶液上层清液，于上

13、样孔中分别上样15、20、30、40、50L(毒素蛋白含量约为7.525 g)，作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液(毒素蛋白含量约为15g).加人到上样孔中，注入电极缓冲液后，接通电源。c)电泳同4.3.1.5c)。d)染色同4.3. 1. 5d)。e)脱色同4.3.1. 5e)。4.3.2.6 测定用手术刀刮下待测区带，放于玻璃试管中，再加25%毗睫(体识百分数)3.0mL.于3TC下振荡洗脱毒素蛋白所吸附的考克斯亮蓝(CBB)R-250.平衡后用分光光度计，以25%毗睫为参比，于605nm 下，测定溶液的吸光度，用式(1)计算毒素蛋白含量。4. 3. 2.7 允许差取其算术平均值

14、为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%，4.4 毒力效价的测定按HG3616一1999附录目标准的附录)进行。4.5 pH值的测定按GB/T1601进行。4.6 细度的测定按GB/T16150-1995中2.2进行测定。4. 7 悬浮率测定4. 7. 1 操作步骤称取样品200.0mg (精确到0.1mg).放人盛有玻璃珠的三角瓶中，加人标准硬水100mL.用手左右振荡60次。制得的悬浮液全部转移到250mL具塞量筒中，用标准硬水稀释到250mL，按GB/T 14825-93中3.1进行。4.7.2 计算悬浮率(Y)按式(2)计算z1170 HG 3617-1999 yIII-KC-

15、Q一一一c一一一式中:c-一一配置悬浮液所取试样的毒力效价，IU;Q 留在量筒底部的25mL悬浮液的毒力效价，IU.4.7.3 允许差二次重复测定结果之差应不超过10% 4.8 湿润时间的测定按GB/T5451进行。4.9 水分的测定按GB/T1600-1979(1989)中共沸蒸馆法进行测定。5 槛骏规则应符合GB/T1604有关规定。极限数值按GB/T1250处理.6 标志、标签、包装、贮运6. 1 产品包装应符合GB3796规定，并应注明所用标准编号。6.2 可湿性粉剂产品主要采用塑料袋包装，密封。6.3 贮存时严防日晒，匆受压，置于阴凉干燥处。6.4 运输时，注意轻放，防止损坏。 ( 2 ) 6. 5 保证期g在正常贮运条件下，可湿性粉剂的质量保班期从生产日期算起为二年，产品出厂时毒力效价和毒素蛋白含量不低于3.2指标，两年内产品毒力效价和毒素蛋白含量均不低于3.2指标的70%。1J 71