SN T 5227.10-2019 出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA法).pdf
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1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5227.10 2019 出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) Rapid detection of marten derived ingredient in food for export Recombinase-aid amplification (RAA) method 2019-12-27发布 2020-07-01 实施 ICS 67.050 C 53 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5227.102019 I 前 言 SN/T 5227
2、2019出口食品中动物源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法)预计分为以下部分: 第 1 部分:出口食品中鸡源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 2 部分:出口食品中猪源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 3 部分:出口食品中羊源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 4 部分:出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 5 部分:出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 6 部分:出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替
3、换核酸扩增法(RAA 法); 第 7 部分:出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 8 部分:出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 9 部分:出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 10 部分:出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 11 部分:出口食品中大鼠源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法)。 本部分为 SN/T 52272019 第 10 部分。 本部分是根据 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本部分由
4、中华人民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位:中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国成都海关、中华人民共和国拱北 海关、中华人民共和国合肥海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京海关、中华人民共 和国大连海关、中华人民共和国厦门海关、杭州众测生物科技有限公司。 本部分主要起草人:苗丽、林华、罗宝正、陈静、宗凯、王娉、汪琳、郑秋月、徐淑菲、孔繁 德、程奇。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5227.102019 出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) 1 范围 SN/T 52272019 的本部分规定了出口食品中貂源性成分的 R
5、AA 检测方法。 本部分适用于出口食品中貂源性成分的定性检测。 2 规范性引用文件 本部分所规定方法的最低检出限(LOD)为 0.1 %(W/W)。 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 274032008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 貂 Martes 食肉目,裂脚亚目,鼬科,鼬亚科,貂属。常见的有以下几种:美洲貂、黄喉
6、貂(青鼬)、石貂 (榉貂)、松貂(林貂)、日本貂、渔貂、紫貂(黑貂)。我国产石貂、紫貂、渔貂、黄喉貂四种。 3.1.2 实时荧光 RAA real-time RAA 一种重组酶介导链替换的恒温核酸快速扩增技术(简称 RAA 技术)。利用从细菌或真菌中获得的 重组酶,在恒温下(一般为 37 42 ),该重组酶可与引物紧密结合,形成酶和引物的聚合体,在 单链 DNA 结合蛋白的帮助下,打开模板 DNA 的双链结构,当引物在模板 DNA 上搜索到与之完全匹 配的互补序列时,在 DNA 聚合酶的作用下,形成新的 DNA 互补链,扩增产物以指数级增长。利用荧 光探针的标记,随着 RAA 反应的进行,RA
7、A 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 3.1.3 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 3.1.4 T 值 time threshold 每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所需要的时间。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5227.102019 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BS-recA :枯草芽孢杆菌重组酶( Bacillus subtilis recombinase)。 Bsu :枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis)。 CTAB :十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium brom
8、ide)。 DNA :脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)。 dNTPs :脱氧核苷三磷酸(deoxyribonuleoside triphosphate)。 EDTA :乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)。 RAA :重组酶介导扩增(recombinase-aid amplification)。 SC-recA :天蓝色链霉菌重组酶( Streptomyces coelicolor recombinase)。 SSB :单链 DNA 结合蛋白(single stranded DNA binding protein)。 Tric
9、ine :N- 三羟甲基甲基氨基酸(N-tris Hydroxymethyl methylglycine)。 Tris :三羟甲基氨基甲烷 tris(Hydroxymethyl)aminomethane。 4 方法提要 以提取的 DNA 为模板,采用貂的特异性检测引物和探针进行实时荧光 RAA 扩增,根据实时荧光 RAA 的增幅情况,实现对食品和饲料中貂成分的检测鉴定。 5 试剂和材料 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均 用无 DNA 酶污染的容器分装。 表 1 检测用引物和探针 物种名称 引物 / 探针序列(5 3 ) 扩增片段长
10、度 靶基因 貂 F :ATTCTCACCTGACCTGTTAGGAGACCCAGAC 269bp 线粒体细胞色素 b 基因(Cytb) R :TAAGGAGATCAGCTACTAGTAATCAGAACAAGC P :ACTTCCTATTCGCATATGCTATCCTA CGAFAM-dTCTHFABQH-dTCCCTAATAAACTAG-C3spacer 注: 目的基因序列参见附录 A。F 为上游引物,R 为下游引物,P 为探针,FAM-dT,THF,BQH-dT 和 C3spacer 均为探针修饰基团。 5.1 CTAB 提取缓冲液(pH8.0):10 g/L CTAB,0.7 mol/L
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