SN T 5196-2020 猪轮状病毒感染检疫技术规范.pdf

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1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5196 2020 代替 SN/T 11622002 猪轮状病毒感染检疫技术规范 Quarantine protocol for infection with porcine rotavirus 中华人民共和国海关总署发 布 ICS 11.220 CCS B 41 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T 5196 2020 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。 本文件由中国人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国福

2、州海关、中华人民共和国南京海关、中华人民共和国南宁 海关、中华人民共和国深圳海关、中华人民共和国海口海关、厦门瑞德利校准检测技术有限公司。 本文件主要起草人：张体银、姜焱、聂丹、郑腾、花群义、李丹丹、王武军、白泉阳、张志灯、 于师宇、陈美传。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5196 2020 猪轮状病毒感染检疫技术规范 1范围 本文件规定了猪轮状病毒感染酶联免疫吸附试验、反转录 - 聚合酶链反应和实时荧光反转录 - 聚合酶链反应检测技术。 本文件适用于猪轮状病毒感染的抗体检测和病原核酸鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条

3、款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088出入境动物检疫采样 GB 19489实验室生物安全通用要求 3术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件： cDNA 互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid） Ct 循环阈值（cycle threshold） ddH 2 O 双蒸水（couble-distillation H 2 O） DEPC 焦碳酸二乙酯（diet

4、hy pyrocarbonate） dNTP 三磷酸脱氧核苷酸（deoxynucleoside triphosphate） EB 溴化乙锭（ethidium bromide） ELISA 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay） HRP 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase） OD 值 光密度值（optic density value） PBS 磷酸盐缓冲液 （phosphate-buffered saline buffer） PRV 猪轮状病毒（porcine rotavirus） RNA 核糖核酸（ribonucleic

5、 acid） RT-PCR 反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction） TBE 三羟甲基氨基甲烷 - 硼酸 - 乙二胺四乙酸（trihydroxymethyl aminomethane-boric acid- ethylene diamine tetraacetic acid ） 4仪器和设备 4.1级生物安全柜。 4.2高压灭菌器。 4.396 孔酶标板。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5196 2020 4.4恒温培养箱。 4.5洗板机。 4.6酶标仪。 4.7冷冻离心机。 4.8单道可调微量移液器（2 L20

6、 L，20 L200 L，100 L1 000 L ）。 4.9多道可调微量移液器（10 L100 L ）。 4.10PCR 仪。 4.11水平电泳仪。 4.12凝胶成像仪。 4.13荧光 PCR 仪。 4.14冰箱（2 8 和 20 ）。 5试剂和材料 5.1水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 5.2猪轮状病毒 VP6 蛋白。 5.3标准阳性血清：猪轮状病毒疫苗免疫仔猪制备，经病毒中和试验检测为阳性。 5.4标准阴性血清：无母源抗体、未免疫猪轮状病毒疫苗的仔猪血清，经病毒中和试验检测为阴性。 5.5灭菌生理盐水：配制见附录 A 中 A.1。 5.6包被液：配制见附录 A 中 A.

7、2。 5.7磷酸盐缓冲液（PBS）：配制参见附录 A 中 A.3。 5.8洗涤液：配制见附录 A 中 A.4。 5.9封闭液：配制见附录 A 中 A.5。 5.10样品稀释液：配制见附录 A 中 A.6。 5.11抗猪 PRV 酶标抗体。 5.12底物显色液：配制见附录 A 中 A.7。 5.13终止液：配制见附录 A 中 A.8。 5.14焦碳酸二乙酯处理水（DEPC 水）：配制见附录 A 中 A.9。 5.15Trizol。 5.16三氯甲烷。 5.17异丙醇。 5.18无水乙醇。 5.19反转录试剂盒。 5.20 Taq DNA 聚合酶。 5.21dNTPs（含 dCTP、dGTP、dA

8、TP、dTTP）。 5.2210PCR 缓冲液。 5.23琼脂糖。 5.24分子量标准（100 bp 600 bp）。 5.25TBE 电泳缓冲液，配制见附录 A 中 A.10。 5.26上样缓冲液，配制见附录 A 中 A.11。 5.27EB（10 mg/mL），配制见附录 A 中 A.12。 5.28DNA 纯化回收试剂盒。 5.29 质控物质：阳性对照为含 PRV 的阳性组织或含有 PRV 的病毒培养液；阴性对照为不含 PRV 的 组织。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5196 2020 5.30RT-PCR 用引物 F1、R1 序列： 上游引物 F1 ：5- AAAGATGCTAG

9、GGACAAAATTG-3； 下游引物 R1 ：5- TTCAGATTGTGGAGCTACTCCA-3。 扩增 PRV 各毒株保守序列中大小为 309 bp 片段（参见附录 B），引物用 ddH 2 O 溶解至 10 mol/L 后， 保存于 -20 备用。 5.31实时荧光 RT-PCR 用引物 F2、R2 和探针序列： 上游引物 F2 ：5- AGCATGTTGATTAAGTGAGGACT-3 下游引物 R2 ：5- ACAGTTACTCTACGTAGCGAGT-3； 探针序列为 FAM-AGGCTAACTACCTGGTATCCGA-TAMRA。 引物和探针分别用 ddH 2 O 溶解至

10、10 mol/L 后，保存于 -20 备用。 6采样和制样 6.1 根据 GB/T 18088 确定采样动物数量；涉及病原检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废 弃物处理应按照 GB 19489 要求进行。 6.2血清样品：通过前腔静脉采血法无菌采血，待其自然凝固后，4 000 r/min 离心 10 min。 6.3 粪便或肛拭子样品：采集粪便样品，加等体积灭菌生理盐水研磨匀浆，4 5 000 r/min离心 15 min，收集上清液待检。采集肛拭子样品，用少量灭菌生理盐水浸润后，取上清液待检。 6.4 组织样品：采集肠、胃等组织样品，加等体积灭菌生理盐水研磨匀浆，4 5 000 r/

11、min离心 15 min，收集上清液待检。 7ELISA 检测方法 7.1操作步骤 7.1.1 包被抗原：将纯化的 VP6 蛋白用包被液稀释至 3 g /mL，每孔 100 L，包被酶标板，封口后， 2 8 包被 12 h。ELISA 检测方法可以采用等效的商品化 ELISA 抗体检测试剂盒，根据试剂盒说明 书进行操作。 7.1.2 弃去孔内液体，每个反应孔加入约 300 L 的洗涤液进行洗涤，洗涤 5 次，最后一次在洁净的吸 水纸上将酶标板拍干。 7.1.3封闭：每孔加入封闭液 250 L，置 37 培养箱中封闭 2 h。 7.1.4重复步骤 8.1.2，置于 4保存备用。 7.1.5将待检

12、血清用样品稀释液作 1 : 100 稀释，每孔加入 100 L，同时加入阴性对照和阳性对照血清各 2 孔，每孔 100 L。置于 37 培养箱中反应 1 h。 7.1.6重复步骤 8.1.2。 7.1.7将抗猪 PRV 酶标抗体稀释至工作浓度，每孔加入 100 L，置于 37 培养箱中反应 1 h。 7.1.8重复步骤 8.1.2。 7.1.9显色：每孔加入 100 L 底物显色液，轻柔摇匀，37 避光显色 10 min。 7.1.10终止反应：每孔加入 100 L 终止液终止反应。 7.1.11读数：在酶标仪上读取 450 nm 吸光值。 7.2结果判定 7.2.1 在酶标测定仪上检测各孔光

13、吸收值（OD 450 ），计算阳性对照平均 OD 450 值和阴性对照平 均 OD 450 值。阳性对照血清平均 OD 450 值大于 0.6，阴性对照血清平均 OD 450 值小于 0.16，试验 以正式出版文本为准 4 SN/T 5196 2020 成立。 7.2.2当样品孔平均 OD 450 值（P）与阴性对照平均 OD 450 值（N）之比大于或等于 2.0（即 P/N 2.0）时， 判定为 PRV 抗体阳性。 7.2.3 当样品孔平均 OD 450 值（P）与阴性对照平均 OD 450 值（N）之比小于 2.0（即 P/N 2.0）时，判 定为 PRV 抗体阴性。 8RT-PCR 方

14、法 8.1设立对照 每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照可用 DEPC 水代替样品；阴性对照为 不含 PRV 的组织；阳性对照为含 PRV 的阳性组织或含有 PRV 的病毒培养液。 8.2RNA 提取 分别取 200 L 待检样品，加入 1 mL Trizol 试剂，用移液器充分吹打 1020 次，室温放置 5 min ； 加入 200 L 三氯甲烷，旋涡振荡 30 s 混匀，室温放置 15 min ；12 000 r/min 离心 15 min ；取上层水 相至一新的离心管中，加等体积异丙醇，上下颠倒数次混匀，-20 放置 20 min ；12 000 r/min 离心 15

15、 min ；弃上清液，沉淀用 1 mL 75乙醇清洗；10 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，沉淀室温干燥 5 min ；加 20 L DEPC 水溶解 RNA 沉淀。-20 冰箱保存备用，RNA 溶液应避免反复冻融，并尽快 用于检测。空白对照、阴性对照和阳性对照进行同步操作。 RNA 提取也可采用等效的商品化 RNA 提取试剂盒，代替以上方法。 8.3cDNA 合成 8.3.1变性和退火 反转录合成 cDNA 可选用等效的商品化试剂盒，下面以 Promega 1） 公司的反转录试剂盒（Reverse Transcription System）进行 cDNA 合成。在 200

16、L PCR 管中加入 10 L RNA 模板，70 孵育 10 min， 短暂离心后置于冰上。 8.3.2cDNA 合成 在另一个 200 L PCR 管中加入 MgCl 2 2.5 L 、反转录 10 缓冲液 2.5 L、dNTP 2.5 L、重组的 Rnasina 核糖核酸酶抑制剂 0.5 L、AMV 反转录酶 20 U、随机引物 1 L、RNA 模板 4 L，补充 DEPC 水至 25 L。将反应体系在室温下温育 10 min，然后在 42 下孵育 60 min。反应结束后，95 5 min 灭活反转录酶，冰浴 5 min。 8.4PCR 扩增 DNA 8.4.1反应体系 普通 PCR

17、反应体系见表 1。PCR 扩增可以采用等效的商品化 DNA 扩增试剂盒。 1）使用 Promega 公司的反转录试剂盒进行描述只是为了叙述方便，并不代表推荐 Promega 的产品，标准的使用 人可以使用其他公司的同类产品。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5196 2020 表 1普通 PCR 反应体系 名称 储存液浓度 终浓度 加样量 / L 10PCR 缓冲液 10 1 2.5 Taq DNA 聚合酶 5 U/L 0.1 U/L 0.5 dNTPs 10 mmol/L 0.2 mmol/L 0.5 上游引物 Cri-F1 10 mol/L 0.4 mol/L 1 下游引物 Cri-R1

18、 10 mol/L 0.4 mol/L 1 cDNA 2 ddH 2 O 17.5 总体积 25 注： 反应体系中各试剂的量可根据反应体系总体积进行适当调整。 8.4.2反应条件 将含有反应液的 PCR 管瞬时离心后，置于 PCR 仪。94 预变性 7 min ；94 变性 30 s，56 退火 30 s，72 延伸 30 s，35 个循环；72 延伸 7 min ；4 保存。 8.4.3琼脂糖凝胶电泳 用TBE电泳缓冲液配制1.5 %的琼脂糖，加热完全溶解后，制成凝胶平板。待冷却后，取下梳子， 将凝胶平板放入水平电泳槽，加入电泳缓冲液至充分没过凝胶面。将 8 L PCR 产物和 2 L 电泳

19、加样 缓冲液混匀后加入凝胶孔中进行电泳。在电泳时设立 DNA 标准分子量 100 bp600 bp Marker 作对照。 5 V/cm8 V/cm 电泳约 50 min，当溴酚蓝到达凝胶块底部时停止电泳。 8.4.4凝胶成像分析和测序 将电泳完毕的凝胶放入含0.5 g/mL EB（或等效商品化核酸染料代替EB）溶液中染色 10 min30 min 后，使用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经 PCR 扩增并电泳后如出现大 小约 309 bp 的 DNA 片段，应对其切胶利用 DNA 纯化回收试剂盒回收后进行测序，也可直接送 PCR 产物进行测序，参考序列参见附录 B，同源性要达到 94

20、% 以上方可判为阳性。 8.5结果判定 经 PCR 扩增并电泳后阳性对照出现一条大小约 309 bp 的 DNA 片段，而阴性对照和空白对照无 条带时，试验成立。待检样品经 PCR 扩增并电泳后，如果出现大小约 309 bp 的核酸条带并经测序验 证者为 PRV 核酸阳性。无条带或条带的大小不是约 309 bp 的为 PRV 核酸阴性。 9实时荧光 RT-PCR 9.1核酸提取 同 8.2。 9.2cDNA 合成 同 8.3。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5196 2020 9.3实时荧光 PCR 扩增 9.3.1反应体系 实时荧光 PCR 反应体系见表 2。实时荧光 PCR 扩增可以采

21、用等效的商品化荧光定量 PCR 试剂盒。 表 2实时荧光 PCR 反应体系 名称 储存液浓度 终浓度 加样量 / L 10PCR 缓冲液 10 1 2.5 Taq DNA 聚合酶 5 U/L 0.1 U/L 0.5 dNTPs 10 mmol/L 0.2 mmol/L 0.5 上游引物 Cri-F2 10 mol/L 0.2 mol/L 0.5 下游引物 Cri-R2 10 mol/L 0.2 mol/L 0.5 探针 qPCR-P 10 mol/L 0.2 mol/L 0.5 cDNA 2 ddH 2 O 18 总体积 25 注：反应体系中各试剂的量可根据反应体系总体积或不同仪器的要求进行适

22、当调整。 9.3.2反应程序 95 预变性 5 min ；之后 95 变性 15 s，61 退火 30 s，收集荧光，共 40 个循环。同时设阳性 对照、阴性对照和空白对照。 9.4结果判断 9.4.1 综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚 好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择 FAM 通道进行分 析。 9.4.2 阳性对照样品有对数扩增曲线，而且 Ct 值小于或等于 30 ；阴性对照和空白对照无扩增曲线， 而且 Ct 值大于 40 或未检出，二者均成立才可判定试验成立。 9.4.3检验样本 Ct 值小于或等于

23、 35 时，报告 PRV 核酸阳性。 9.4.4 检验样本 Ct 值大于 35、小于或等于 40 时，重复一次，如果 Ct 值仍然小于或等于 40，并且曲线 有明显的对数增长期，报告 PRV 核酸阳性，否则报告 PRV 核酸阴性。 9.4.5检验样本 Ct 值为零或 Ct 值大于 40 时，报告 PRV 核酸阴性。 以正式出版文本为准 7 SN/T 5196 2020 附录A （规范性） 试剂配制 A.1灭菌生理盐水 NaCl 8.5 g 蒸馏水 1 000 mL 溶解混匀后 121 高压灭菌 15 min。 A.2包被液（0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液，pH9.6） 碳酸钠（Na 2 C

24、O 3 ，分析纯） 1.59 g 碳酸氢钠（NaHCO 3 ，分析纯） 2.93 g 蒸馏水 加至 1 000 mL 溶解后，调节 pH 值至 9.6，4 保存备用。 A.3璘酸盐缓冲液（0.01 mol/L PBS，pH7.4） 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ，分析纯） 0.2 g 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 12H 2 O，分析纯） 2.9 g 氯化钠（NaCl，分析纯） 8 g 氯化钾（KCl，分析纯） 0.2 g 蒸馏水 加至 1 000 mL 溶解后，调节 pH 值至 7.4，保存于 4 备用。 A.4PBST 洗涤液（含 0.01 mol/L PBS-0.05 % 吐温 -

25、20，pH7.4） 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ，分析纯） 0.2 g 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 12H 2 O，分析纯） 2.9 g 氯化钠（NaCl，分析纯） 8 g 氯化钾（KCl，分析纯） 0.2 g 吐温 -20（分析纯） 0.5 mL 蒸馏水 加至 1 000 mL 溶解后，调节 pH 值至 7.4，现用现配。 A.5封闭液 脱脂乳 5 g，加 PBST 定容至 100 mL，现配现用。 A.6血清稀释液 同 B.4 封闭液。 以正式出版文本为准 8 SN/T 5196 2020 A.7底物显色液（TMB- 过氧化氢尿素溶液） A.7.1底物液 A TMB（分析纯） 2

26、00 mg 无水乙醇（或 DMSO） 100 mL 蒸馏水 加至 1 000 mL A.7.2底物缓冲液 B 磷酸氢二钠（分析纯） 71.7 g 柠檬酸（分析纯） 9.33 g 0.75% 过氧化氢尿素 6.4 mL 蒸馏水 加至 1 000 mL 调 pH 值至 5.05.4。 A.7.3制法 将底物液 A 和底物缓冲液 B 按 11 混合，即成底物显色液，现配现用。 A.8终止液（2 mol/L 硫酸溶液） 取分析纯浓硫酸（含量 95%98%）22.2 mL 缓缓加入到 177.8 mL 蒸馏水中，混匀即成 2 mol/L H 2 SO 4 终止液。 A.9焦碳酸二乙酯处理水（DEPC 水

27、） 超纯水 100 mL DEPC 100 L 混合后室温放置过夜，121 高压灭菌 15 min，或直接购买商品化的产品。 A.10TBE 电泳缓冲液（5 浓缩液） Tris 54 g 硼酸 27.5 g EDTA 2.9 g 加蒸馏水至 1 000 mL 用 5 mol/L 的盐酸（HCl）调到 pH 8.0，或直接购买商品化的产品。 A.11上样缓冲液 溴酚蓝 0.25 g 蔗糖 40 g 蒸馏水 100 mL 溶解混匀后 121 高压灭菌 15 min。 以正式出版文本为准 9 SN/T 5196 2020 A.12溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB） 溴化乙锭（EB）

28、100 mg 蒸馏水 10 mL 用蒸馏水配制成 10 mg/mL 的浓缩液。用时每 100 mL 染色液中加 10 L 的浓缩液。 以正式出版文本为准 10 SN/T 5196 2020 附录B （资料性） 扩增产物参考基因序列 B.1RT-PCR 扩增产物的参考序列，大小为 309 bp，基因序列如下 aaagatgctagggacaaaattgttgaaggtacgttatattctaatgttagcgatctcatccaacaatttaatcaaatgatagtgactatgaatggaaatgactttca aactggaggaattggtaacttacctattaggaattgga

29、attttgattttggtctattaggtacaacacttctaaatttggatgccaattatgttgagaatgcaagaactacaat tgaatatttcattgactttattgataatgtgtgtatggatgaaatggcaagagagtctcaaagaaatggagtagctccacaatctgaa B.2实时 RT-PCR 扩增产物的参考序列，大小为 129 bp，基因序列如下 agcatgttgattaagtgaggactaggctaactacctggtatccgatcttaatcaacatgtagctatgtcaagtcaatcagactctgcaagtaa

30、gggtatgatttcat actcgctacgtagagtaactgt 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1 字数 30 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1500 书号：15517537 定价 18.00 元 猪轮状病毒感染检疫技术规范 行 业 标 准 SN/T 51962020 * * * SN/T 5196 2020 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址