SN T 5171-2019 出口植物源性食品中去甲乌药碱的测定 液相色谱-质谱 质谱法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 51712019 出口植物源性食品中去甲乌药碱的测定 液相色谱 - 质谱 / 质谱法 Determination of higenamine in plant-origin foodstuffs for export LC-MS / MS method 2019-10-25 发布 2020-05-01 实施 中华人民共和国海关总署 发 布 ICS 67.050 C 53 I SN / T 51712019 前 言 本标准按照 GB / T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国

2、武汉海关、湖北省体育科学研究所、湖北省食品质量安全监 督检验研究院、中华人民共和国南京海关。 本标准主要起草人：王晗、赵晓亚、汤一铸、王鹏、张莉、高玲、叶诚、罗静、王振华。 1 SN / T 51712019 出口植物源性食品中去甲乌药碱的测定 液相色谱 - 质谱 / 质谱法 1 范围 本标准规定了出口植物源食品中去甲乌药碱残留量的液相色谱 - 质谱 / 质谱的测定方法。 本标准适用于白菜、火龙果、橙子、花生、辣椒、川芎中去甲乌药碱残留量的测定，其他食品 也可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的

3、引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 2763 食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法提要 试样加入 0 .5% 甲酸乙醇溶液提取，提取液经分散固相萃取法净化，液相色谱 - 质谱 / 质谱 仪测定，内标法定量。 4 试剂和材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为 GB / T 6682 规定的一级水。 4.1 甲酸（HCOOH，CAS 号：64-18-6） 。 4.2 乙醇（C 2 H 5 OH，CAS 号：64-17-5）：色谱纯。 4.3 甲醇（CH 3 OH，CAS 号：67-56-1）：色谱纯

4、。 4.4 乙酸铵（CH 3 COONH 4 ，CAS 号：631-61-8）。 4.5 无水硫酸镁（MgSO 4 ，CAS 号：7487-88-9）。 4.6 去甲乌药碱标准物质（C 16 H 17 NO 3 ，CAS 号：5843-65-2）：纯度大于等于 99%。 4.7 非诺特罗标准物质（C 17 H 21 NO 4 ，CAS 号：13392-18-2）：纯度大于等于 99%。 4.8 0.5% 甲酸乙醇溶液：移取 1.0 mL 甲酸（4.1），用乙醇（4.2）定容至 200 mL，混匀。 4.9 0.1% 甲酸甲醇溶液：移取 1.0 mL 甲酸（4.1），用甲醇（4.3）定容至 1

5、000 mL，混匀。 4.10 0.1% 甲酸 -0.5 mmol / L 乙酸铵水溶液：称取 0.038 5 g 乙酸铵（4.4），用水溶解，向其中加入 1.0 mL 甲酸（4.1），定容至 1 000 mL，混匀。 4.11 去甲乌药碱标准储备液：称取适量去甲乌药碱标准物质（4.6） （精确至0.000 1 g），用甲醇（4.3） 溶解，配制成浓度为 1.0 mg / mL 的标准储备液，于 -18 以下避光保存。 4.12 非诺特罗标准储备液：称取适量非诺特罗标准物质 （4.7）（精确至 0.000 1 g），用甲醇（4.3） 溶解，配制成浓度为 1.0 mg / mL 的标准储备液，于

6、 -18 以下避光保存。 2 SN / T 51712019 4.13 去甲乌药碱标准中间液：准确移取 1.0 mL 去甲乌药碱标准储备液（4.11）于 100 mL 容量瓶中， 用甲醇（4.3）定容至刻度，配制成浓度为 10 g / mL 的标准中间液，于 -18 冰箱内储存。 4.14 非诺特罗内标中间液：准确移取 1.0 mL 非诺特罗标准储备液（4.12）于 100 mL 容量瓶中，用甲 醇（4.3）定容至刻度，配制成浓度为 10 g / mL 的内标中间溶液，于 -18 冰箱内储存。 4.15 标准工作溶液 ：准确移取适量去甲乌药碱标准中间液（4.13）和非诺特罗内标中间液（4.14

7、）， 用初始流动相稀释成去甲乌药碱浓度分别为 3.0 ng / mL、5.0 ng / mL、10 ng / mL、30 ng / mL、50 ng / mL 的 系列标准溶液，并保证各标准溶液中非诺特罗内标浓度为 10 ng / mL。 4.16 乙二胺 -N- 丙基硅烷化硅胶（PSA）： 40 m60 m。 4.17 十八烷基硅烷键合硅胶（C 18 ）：40 m60 m。 4.18 石墨化碳黑（GCB）：40 m60 m。 4.19 微孔滤膜：有机系，0.22 m。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱 - 质谱 / 质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。 5.2 组织捣碎机。 5.3 振荡器。

8、5.4 涡旋混合器。 5.5 电子分析天平：感量为 0.000 1 g 和 0.01 g。 5.6 离心机：转速不低于 8 000 r / min。 5.7 氮气吹干仪。 6 试样制备与保存 蔬菜、水果及药用植物的取样部位按照 GB 2763 的规定执行，取样品 500 g，用组织捣碎机均质， 充分混匀，均分为 2 份，密封并标明标记，于 -18 条件下保存。 坚果样品去壳取全果 500 g，用组织捣碎机均质，充分混匀，均分为 2 份，密封并标明标记，于 0 4 条件下保存。 调味料样品去柄、去根取全果或整棵 500 g，用组织捣碎机均质，充分混匀，均分为 2 份，密封 并标明标记，于 0 4

9、 条件下保存。 7 测定步骤 7.1 提取 称取约 2 g 试样（精确至 0.01 g）置于 50 mL 离心管中，加入 20 L 非诺特罗内标中间液（4.14）， 加入 20 mL 0.5% 甲酸乙醇溶液（4.8），涡旋混匀，振荡提取 30 min，以 8 000 r / min 的转速离心 5 min，待净化。 7.2 净化 取 2 mL 7.1 中的待净化上清液于 10 mL 净化管中，加入 50 mg PSA（4.16）、50 mg C 18 （4.17）、7.5 mg GCB（4.18）和 150 mg 无水硫酸镁（4.5），涡旋混合，以 8 000 r / min 的转速离心 5

10、min，取上清液过 微孔滤膜（4.19），供液相色谱 - 质谱 / 质谱仪测定。 3 SN / T 51712019 7.3 测定 7.3.1 液相色谱条件 7.3.1.1 色谱柱：C 18 色谱柱，100 mm3.0 mm（内径），粒径 3.5 m 或性能相当者。 7.3.1.2 柱温：30 。 7.3.1.3 流动相：A 为 0.1% 甲酸 -0.5 mmol / L 乙酸铵水溶液（4.10），B 为 0.1% 甲酸甲醇溶液（4.9）， 梯度洗脱，洗脱程序见表 1。 表 1 液相色谱的梯度洗脱程序 时间 / min 流动相 A / % 流动相 B / % 0.00 95 5 2.00 95

11、 5 3.00 45 55 5.00 45 55 6.00 5 95 8.00 5 95 8.10 95 5 10.00 95 5 7.3.1.4 流速：0.4 mL / min。 7.3.1.5 进样量：5 L。 7.3.2 质谱条件 7.3.2.1 离子源：电喷雾离子源（ESI）。 7.3.2.2 扫描方式：正离子扫描。 7.3.2.3 检测方式：多反应监测模式（MRM）。 7.3.2.4 监测离子对、定量离子对见表 2。 表 2 去甲乌药碱的监测离子对、定量离子对和非诺特罗的定量离子对 被测物 监测离子对（m / z） 定量离子对（m / z） 去甲乌药碱 272.0 / 107.0 2

12、72.0 / 255.0 272.0 / 107.0 非诺特罗 304.2 / 135.3 7.3.2.5 雾化气、气帘气 、辅助气、碰撞气均为高纯氮气及其他适合气体，使用前应调节各气体流 量以使质谱灵敏度达到检测要求，喷雾电压、去簇电压、碰撞气能量等参数值应优化至最佳灵敏度， 其他参考质谱参数参见附录 A。 7.3.3 液相色谱 - 质谱 / 质谱测定 7.3.3.1 定性测定 按照液相色谱 - 质谱 / 质谱条件测定试样和标准工作液，试样中目标化合物的保留时间与标准工 4 SN / T 51712019 作液中对应化合物的保留时间偏差在 2.5% 之内；定性离子对的相对丰度与浓度相当的标准

13、工作液 的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表 3 的规定，且每个离子的信噪比均 3，则可判断试样中存 在相应的被测物。 表 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 / % 50 2050（含） 1020（含） 10 允许的相对偏差 / % 20 25 30 50 7.3.3.2 定量测定 将标准工作液和试样溶液依次注入液相色谱 - 质谱 / 质谱仪中，测得定量离子峰面积。标准工作 液和待测液中，去甲乌药碱和非诺特罗的响应值均应在仪器检测的定量线性范围内。在上述仪器条件 下，去甲乌药碱的提取离子色谱图参见附录 B。 7.4 空白试验 除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。 8

14、 结果计算和表述 采用标准工作曲线定量，试样中去甲乌药碱的含量由液相色谱 - 质谱 / 质谱仪的数据处理软件或 按式（1）计算，计算结果应扣除空白值。 （1） 式中： X试样中被测组分含量，单位为微克每千克（ g / kg）； c 从基质标准工作曲线得到的样液中被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng / mL）； V提取液体积，单位为毫升（mL）； m试样质量，单位为克（g）； f 稀释因子。 注：结果保留 3 位有效数字。 9 检出限、定量限和回收率 9.1 检出限和定量限 白菜、火龙果、橙子、花生、辣椒、川芎中去甲乌药碱的检出限为 10.0 g / kg，定量限为 30.0 g / kg

15、。 9.2 回收率 白菜、火龙果、橙子、花生、辣椒、川芎中去甲乌药碱的添加水平和回收率数据参见附录 C。 5 SN / T 51712019 附 录 A （资料性附录） a 质谱参考参数 1） A.1 电喷雾电压（IS）：4 500 V。 A.2 离子源温度（TEM）：320 。 A.3 气帘气压力（CUR，kPa）：241 （氮气）。 A.4 雾化气压力（GS1，kPa）：413 （氮气）。 A.5 辅助气压力（GS2，kPa）：344 （氮气）。 A.6 碰撞气能量（CE）、去簇电压（DP）见表 A.1。 1）非商业性声明：本标准中所列参数是在 AB SCIEX 6500 质谱仪完成的，此

16、处列出试验用仪器型号仅是为了提 供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家和型号仪器。 表 A.1 去甲乌药碱和非诺特罗主要参考质谱参数 名称 母离子（m / z） 子离子（m / z） 扫描模式 去簇电压（DP） / V 碰撞气能量（CE） / eV 去甲乌药碱 272.0 107.0 * ESI + 40 30 255.0 40 20 非诺特罗 304.2 135.3 ESI + 40 30 注：* 表示定量离子对。 6 SN / T 51712019 附 录 B （资料性附录） 标准物质的提取离子色谱图 图 B.1 去甲乌药碱的提取离子色谱图（3.0 ng / mL） 图 B.

17、2 非诺特罗的提取离子色谱图（10.0 ng / mL） a） b） 7 SN / T 51712019 附录 C （资料性附录） 添加水平及回收率数据 表 C.1 去甲乌药碱在典型基质中的添加水平及其回收率 化合物 样品基质 添加浓度 / （ g / kg） 回收率 / % 相对标准偏差 / % 去甲乌药碱 白菜 30.0 87.9103 5.9 60.0 90.6107 5.8 3.0010 2 85.9105 6.4 火龙果 30.0 82.9108 10.8 60.0 80.3107 11.9 3.0010 2 81.6109 10.7 橙子 30.0 82.2107 10.9 60.

18、0 83.1109 10.8 3.0010 2 83.6109 11.7 花生 30.0 81.9105 8.2 60.0 83.1105 9.1 3.0010 2 93.1108 5.7 辣椒 30.0 89.5107 6.3 60.0 81.4106 8.7 3.0010 2 81.3108 12.0 川芎 30.0 81.1105 11.3 60.0 86.8108 8.4 3.0010 2 81.3110 11.7 9 SN / T 51712019 Foreword This standard was drafted according to GB / T 1.12009. This

19、 standard was proposed by and under the charge of General Administration of Customs, P. R. China. This standard was drafted by Wuhan Customs District P. R. China, Hubei Institute of Sport Science, Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test, Nanjing Customs District P. R. China. This st

20、andard was mainly drafted by Wang Han, Zhao Xiaoya, Tang Yizhu, Wang Peng, Zhang Li, Gao Ling, Ye Cheng, Luo Jing, Wang Zhenhua. 11 SN / T 51712019 Determination of higenamine in plant-origin foodstuffs for exportLC-MS / MS method 1 Scope This standard specifies the method of determination of higena

21、mine in plant-origin foodstuffs for exportLC- MS / MS. This standard is applicable to the determination of higenamine in cabbage, pitaya, orange, peanut, chili and ligusticum wallichii for export. Other foods may also be tested by consulting this standard. 2 Normative references The following docume

22、nts are necessary for this standard. For dated reference， only dated editions shall apply to this standard. For undated reference， the latest edition of the normative document （including subsequent amendments） referred to applies. GB 2763 National food safety standardMaximum residue limits for pesti

23、cides in food GB / T 6682 Water for analytical laboratory useSpecification and test methods 3 Principle The contents of higenamine in the test sample are extracted with 0.5% ethanol-formic acid solution. Thereafter being cleaned up by dispersive solid phase extraction, the contents are determined by

24、 LC-MS / MS, quantified by internal standard method. 4 Reagents and materials Unless otherwise specified, all reagents used should be of analytically pure, “water” is the first grade water prescribed by GB / T 6682. 4.1 Formic acid（HCOOH,CAS No. : 64-18-6）. 4.2 Ethanol （C 2 H 5 OH, CAS No. : 64-17-5

25、）: chromatography pure. 4.3 Methanol （CH 3 OH,CASNo. : 67-56-1）: chromatography pure. 4.4 Ammonium acetate （CH 3 COONH 4 , CAS No. : 631-61-8）. 4.5 Magnesium sulfate anhydrous（MgSO 4 , CAS No. : 7487-88-9）. 4.6 Standard substance of higenamine（C 16 H 17 NO 3 , CAS No. : 5843-65-2）： purity 99 %. 4.7

26、Standard substance of fenoterol（C 17 H 21 NO 4 , CAS No. : 13392-18-2）： purity 99 %. 4.8 0.5% Ethanol- formic acid solution: pipette 1.0 mL formic acid（4.1） and dilute to 200 mL with ethanol（4.2）. 4.9 0.1% Methanol-formic acid solution: pipette 1.0 mL formic acid（4.1） and dilute to 1 000 mL with met

27、hanol（4.3）. 4.10 0.1% Formic acid solution-0.5 mmol / L ammonium acetate solution: weigh 0.038 5 g ammonium acetate（4.4） and dissolve to 1 000 mL with water, add 1.0 mL formic acid（4.1）in the solution. 12 SN / T 51712019 4.11 Standard stock solution of higenamine: weigh appropriate standard substanc

28、es of higenamine （4.6） accurately and dissolve it with methanol（4.3）. The concentration of the solution is 1.0 mg / mL. The stock solution should be stored at -18 refrigerator in dark. 4.12 Standard stock solution of fenoterol: weigh appropriate standard substance of fenoterol（4.7） accurately and di

29、ssolve with methanol （4.3） . The concentration of the solution is 1.0 mg / mL. The stock solution should be stored at -18 refrigerator in dark. 4.13 Intermediate solution of higenamine: pipette1.0 mL of standard stock solution of higenamine（4.11） and dilute to 100 mL with methanol（4.3） . The concent

30、ration of the solution is 10 g / mL. The intermediate solution should be stored at -18 refrigerator in dark. 4.14 Intermediate solution of fenoterol: pipette 1.0 mL of standard stock solution of fenoterol（4.12） and dilute to 100 mL with methanol（4.3） . The concentration of the solution is 10 g / mL.

31、 The intermediate solution should be stored at -18 refrigerator in dark. 4.15 Standard working solution: pipette intermediate solution of higenamine（4.13）and intermediate solution of fenoterol（4.14）accurately and dilute with initial mobile phase to obtain standard working solution with higenamine of

32、 3.0 ng / mL, 5.0 ng / mL, 10 ng / mL, 30 ng / mL and 50 ng / mL and fenotenol of 10 ng / mL. 4.16 PSA: 40 m60 m. 4.17 C 18 : 40 m60 m. 4.18 GCB: 40 m60 m. 4.19 Membrane: organic, 0.22 m. 5 Apparatus and equipment 5.1 High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: equipped with ele

33、ctrospray ionization source （ESI）. 5.2 Tissue blender. 5.3 Oscillator. 5.4 Vortex mixer. 5.5 Analytical balance: accuracte to 0.000 1 g and 0.01g. 5.6 Centrifuge: speed higher than 8 000 r / min. 5.7 Nitrogen evaporator. 6 Sample preparation and storage Take approximately 500 g of representative veg

34、etables, fruits and medicine plants sample according to GB 2763. The sample is blended and homogenized in a tissue blender, divided into two equal portions, and placed into a clean container, sealed and labeled. The sample should be stored below -18 . Take approximately 500 g of representative nuts

35、sample after shelling. The sample is blended and homogenized in a tissue blender, divided into two equal portions, and placed into a clean container, sealed and labeled. The sample should be stored below 0 4 . Take approximately 500 g of representative spices sample after shelling or peeling the roo

36、ts. The sample is blended and homogenized in a tissue blender, divided into two equal portions, and placed into a clean container, sealed and labeled. The sample should be stored below 0 4 . 13 SN / T 51712019 7 Procedure 7.1 Extraction Weigh 2 g of the test sample （accurate to 0.01 g） into a 50 mL

37、centrifuge tube, add 20 L intermediate solution of fenoterol （4.14） and 20 mL 0.5% ethanol - formic acid solution（4.8）, mix intensely and extract with vibrating for 30 min. Then centrifuge for 5 min at 8 000 r / min. Take the supernatant. 7.2 Cleanup Pipette 2 mL of supernatant in 7.1 into a 10 mL c

38、entrifuge tube, add 50 mg PSA（4.16）, 50 mg C 18 （4.17）, 7.5 mg GCB（4.18）and 150 mg magnesium sulfate anhydrous（4.5）, mix intensely. Then centrifuge for 5 min at 8 000 r / min. After being filtrated with a 0.22 m orgaric membrane（4.19）, the supernatant is ready for analysis by LC-MS / MS. 7.3 Determi

39、nation 7.3.1 LC operating conditions 7.3.1.1 LC column: C 18 LC column（100 mm 3.0 mm i.d.），3.5 m or equivalent. 7.3.1.2 Column temperature: 30 . 7.3.1.3 Mobile phase: A is 0.1% formic acid solution-0.5 mmol / L ammonium acetate solution（4.10）, B is 0.1% methanol - formic acid solution（4.9）, the grad

40、e of mobile phase is listed in table 1. Table 1 Grade of mobile phase Time / min Mobile phase A / % Mobile phase B / % 0.00 95 5 2.00 95 5 3.00 45 55 5.00 45 55 6.00 5 95 8.00 5 95 8.10 95 5 10.00 95 5 7.3.1.4 Flow rate: 0.4 mL / min. 7.3.1.5 Injection volume: 5 L. 7.3.2 MS / MS operating conditions

41、 7.3.2.1 Ion source: electrospray ionization source（ESI）. 7.3.2.2 Scanning model: positive ion. 7.3.2.3 Monitoring model: multiple reaction monitor（MRM）. 7.3.2.4 Monitoring ions are listed in table 2. 14 SN / T 51712019 Table 2 Monitoring ions Analyte Monitoring ion pairs（m / z） Quantitative ion pai

42、rs（m / z） Higenamine 272.0 / 107.0 272.0 / 255.0 272.0 / 107.0 Fenoterol 304.2 / 135.3 7.3.2.5 Nebulizer gas, curtain gas and auxiliary gas are high purity nitrogen or other suitable gases. They are optimized by adjusting the gas flow parameters. Ion spray voltage, deflector voltage, collision energ

43、y and so on should be optimized to reach the highest sensitive of mass spectrometer, referenced conditions are showed in annex A. 7.3.3 LC-MS / MS determination 7.3.3.1 Confirmation Under the LC-MS / MS operating conditions, the standard working solution and sample solution are injected. If the rete

44、ntion times of sample are consistent with that of standard solution with the difference less than 2.5%, the relative intensities of sample transitions shall correspond to those of standard solution transitions for confirmation. The concentration of standard solution should be same with those of samp

45、le solution. The signal- to-noise ratio of monitoring ions of sample should be higher than 3. The permitted tolerances listed in table3, then the corresponding analyte must be present in sample. Table 3 Maximum permitted tolerances relative ion intensities while confirmation Relative intensity / % 5

46、0 2050（inclusive） 1020（inclusive） 10 Permitted tolerances / % 20 25 30 50 7.3.3.2 Quantitation determination Standard working solution and sample solution are injected into LC-MS/MS to obtain the peak area of quantitative ion. The responses of analyte in the standard working solution and the sample

47、solution should be within the linear range of the instrument detection. See MRM chromatograms of higenamine and fenoterol in annex B. 7.4 Blank test The operation of the blank test is the same as that described in the method of determination, but with the omission of sample addition. 8 Calculation a

48、nd expression of the result Calculate the content of higenamine in the test sample by LC-MS / MS data processor or according to the followed formula（1） . The Blank values should be deducted from the calculation results. （1） Where: 15 SN / T 51712019 Xthe content of higenamine in the test sample, g /

49、 kg. c the concentration of higenamine obtained from the standard working solution, ng / mL. Vthe volume of extraction solution, mL. mthe mass of the test sample, g. f dilution factor. Note ：Three significant figures should be retained. 9 Limit of detection, quantification and recovery 9.1 Limit of detection and quantification The limit of detection （LOD）for higenamine is 10.0 g / kg and the limit of quantification （LOQ） is 30.0 g / kg in cabbage, pitaya, orange, peanut, chili and ligusticum wallichii. 9.2 Recovery The fortifying concentration of higenamine and the r