SN T 1162-2020 传染性胰脏坏死病检疫技术规范.pdf

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1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1162 2020 代替 SN/T 11622002 传染性胰脏坏死病检疫技术规范 Quarantine protocol for infectious pancreatic necrosis 中华人民共和国海关总署发 布 ICS 65.150 CCS B 50 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T 1162 2020 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。 本文件代替 SN/T 11622002传染性胰脏坏死病毒（IPNV）酶链免疫吸

2、附试验（ELISA）诊断 方法。 本文件与 SN/T 11622002 相比，主要技术变化如下： 增加了临床症状的描述； 增加了 SYBR Green 荧光 RT-PCR 方法； 增加了 RT-PCR 方法； 修改了综合判定。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院。 本文件主要起草人：刘荭、郑晓聪、刘莹、王津津、贾鹏、温智清、何俊强、于力、史秀杰、 兰文升、王红英、叶奕优。 本文件所代替文件的历次版本发布情况为： SN/T 11622002。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 1162 2020 传染性

3、胰脏坏死病检疫技术规范 1范围 本文件规定了传染性胰脏坏死病毒的分离、SYBR Green 实时荧光逆转录聚合酶链式反应、逆转 录聚合酶链式反应、酶联免疫吸附试验的检测方法。 本文件适用于传染性胰脏坏死病的流行病学监测、检测与检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088出入境动物检疫采样 3术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件： BSA ：牛血清白蛋

4、白（bovine serum albumin）； BF-2 ：蓝鳃太阳鱼细胞系（blue fin fish cell line）； CHSE-214 ：大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系（chinook salmon embryo cell line）； Ct ：循环阈值（cycle threshold）； DEPC ：焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate）； dNTP ：三磷酸脱氧核苷酸（deoxynucleoside triphosphate）； ELISA ：酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay）； HRP ：辣根过氧化物酶（hors

5、eradish peroxidase）； OD 值：光密度值（optic density value）； RNA ：脱氧核糖核酸（ribonucleic acid）； RTG-2 ：虹鳟性腺细胞系（rainbow trout gonadal cell line）； RT-PCR ：逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction）。 4概述 传染性胰脏坏死病（infectious pancreatic necrosis, IPN）是由传染性胰脏坏死病毒（infectious pancreatic necrosis virus,

6、 IPNV）引起的一种危害极其严重的传染性、病毒性鱼类疾病，主要流行于鲑 科鱼类的鱼苗和幼鱼（参见附录 A）。 5试剂和材料 5.1水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 5.2DEPC 水：配制方法见附录 B 中 B.1 或购买商品化试剂。 以正式出版文本为准 2 SN/T 1162 2020 5.3IPNV 参考株。 5.4细胞系：CHSE-214、RTG-2 或 BF-2 细胞系。 5.5HEPES ：4- 羟乙基哌嗪乙磺酸。 5.6兔抗 IPNV 参考抗血清。 5.7羊抗 IPNV 抗体。 5.8酶标羊抗兔 IgG ：按照说明书使用。 5.9 引物：用 DEPC 水将每条引物配

7、制成 100 mol/L 储存液，置 -20 以下冻存；使用时，取适量配 制成 20 mol/L 工作液，避免多次冻融。具体序列如下： IPNV F: 5null-ACTACGAACCCCCAGGACAAA-3null ； IPNV R: 5null-GTCTCGTCCTCTAGGCGGACGTA-3null。 用于 SYBR Green 实时荧光 RT-PCR，扩增 IPNV VP2 基因中 122 bp 的片段。 IPNV PrD1 ：5 null-AAAGCCATAGCCGCCCATGAAC-3null ； IPNV PrD2 ：5 null-TCTCATCAGCTGGCCCAGGTAC

8、-3null。 用于 RT-PCR，扩增 IPNV NS 与 VP3 基因之间 174 bp 的片段。 6器材和设备 6.1酶标测定仪。 6.2倒置显微镜。 6.3恒温培养箱。 6.4PCR 扩增仪。 6.5凝胶成像仪。 7IPNV 的分离与鉴定 7.1采样 取样数量按照 GB/T 18088 的规定执行。有临床症状的鱼，体长小于等于 4 cm 的鱼苗取整条，若 是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊；体长 4 cm6 cm 的鱼苗取内脏（包括肾）；体长大于 6 cm 的鱼则取肝、 肾和脾。无临床症状的鱼取肝、肾和脾；成熟的雌鱼还需取卵巢液。鱼卵则取卵壳。 7.2样品处理 应保持在 10 以下进行处理。先

9、用组织研磨器将样品匀浆，再按 110 的最终稀释度悬浮于细 胞培养液（见附录 B 中 B.2）中。如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则须在细胞培养液中加入 1 000 IU/mL 青霉素和 1 000 g/mL 链霉素。于 15 下孵育 2 h 4 h 或 4 下孵育 6 h 24 h。7 000 r/min 离心 15 min，收集上清液。卵巢液不必匀浆，稀释 2 倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后 的步骤中直接用其上清液。 7.3病毒分离 对 1 : 10 的组织匀浆上清液用细胞培养液再做两次 10 倍稀释，然后将 1 : 10、1 : 100、1 : 1 000 3 个 稀释度的

10、上清液，用无菌操作方法，以适当的体积分别接种到生长约 24 h 的 CHSE-214、RTG-2 或 BF-2 细胞单层中，每孔（2 cm 2 ）的细胞单层最多接种 100 L 稀释液。15 20 吸附 0.5 h 1 h 后， 加入细胞培养液。置于 18 2 培养。 阳性对照组和待测样品都接种细胞后，7 d 内每天用倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。 以正式出版文本为准 3 SN/T 1162 2020 如果除阳性对照细胞外，被检匀浆上清稀释液的细胞培养中没有细胞病变（CPE）出现，则在培养 7 d 后还要用敏感细胞再进行传代培养。传代时，冻融并收集接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培

11、养物，以 7 000 r/min 4 离心 15 min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养 7 d，每天 镜检。如果盲传后没有 CPE 出现，则结果判为阴性。 如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养或者盲传后的细胞培养中出现 CPE，应立即应用 SYBR Green 实时荧光 RT-PCR、常规 RT-PCR 或 ELISA 等方法进行 IPNV 鉴定。CPE 表现为局部区 域细胞开始裂解，周围细胞收缩变圆，逐渐发展，细胞最终全部脱落。 如果阳性对照也未出现 CPE，则试验无效，必须换用敏感细胞和一批新的组织样品重新按上述方 法进行病毒学检查。 7.4IPNV 的 SYBR Gre

12、en 实时荧光 RT-PCR 检测 7.4.1设立对照 每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照可用 DEPC 水代替样品；阴性对照 为不含 IPNV 的组织或细胞培养物；阳性对照为含 IPNV 的阳性组织、细胞培养物或含目的片段的 RNA。 7.4.2RNA 抽提 分别取 200 L 待检样品组织上清液或待检样品细胞培养物，加入 1 mL Trizol 试剂，用移液器 充分吹打10次20 次，室温放置 5 min ；加入 200 L三氯甲烷，旋涡振荡30 s混匀，室温放置 15 min ；12 000 r/min 离心 10 min ；取上层水相至一新的离心管中，加等体积异丙醇，

13、上下颠倒数 次混匀，-20 放置 20 min ；12 000 r/min 离心 10 min ；弃上清液，沉淀用 1 mL 75乙醇清洗； 8 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，沉淀室温干燥 5 min ；加 20 L DEPC 水溶解 RNA 沉淀。4 冰 箱保存备用，RNA 溶液应避免反复冻融，并尽快用于检测。 RNA 提取也可采用等效的商品化 RNA 提取试剂盒，代替以上方法。 7.4.3反应体系 在 0.2 mL PCR 反应管中，按表 1 配制反应体系， 加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳 性对照的次序分别加入模板，盖上管盖，充分混匀。 表 1IPNV SYB

14、R Green 荧光 RT-PCR 反应体系（25 L） 组分 加样量 / L 终浓度 10One Step RNA PCR Buffer 2.5 1 MgCl 2 （25 mmol/L） 5 5 mmol/L dNTPs（10 mmol/L each） 2.5 1 mmol/L RNase Inhibitor（40 U/ L） 0.5 0.8 U/L AMVRTase 1） （5 U/ L） 0.5 0.1 U/L Taq DNA 聚合酶（5 U/ L） 0.5 0.1 U/L IPNV F（20 mol/L） 0.25 0.2 mol/L 1）AMV RTase 具有耐受 60 高温的特性

15、，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的唯 一认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 以正式出版文本为准 4 SN/T 1162 2020 组分 加样量 / L 终浓度 IPNV R（20 mol/L） 0.25 0.2 mol/L 10 x SYBR Green 0.5 0.2 RNase Free dH 2 O 10 模板 / 对照 2.5 将已加样的 PCR 反应管短暂离心后放入荧光 PCR 仪，扩增反应条件设定：60 反转录 15 min， 94 预变性 2 min ；94 变性 5 s，58 退火 20 s，72 延伸 35 s，40 个循环；

16、在 72 延伸阶段设 置采集荧光。 7.4.4分析条件设定 以综合分析仪器给出的各项结果、基线（baseline）以及仪器给出的默认值作为参考，阈值设定 以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为原则，具体还需根据仪器噪音情况进行调 整；选择 SYBR 通道进行分析。 SYBR Green 实时荧光 RT-PCR 产物的特异性可用溶解曲线分析来确定。当扩增反应结束后，直 接在荧光PCR仪上运行melting allias程序进行溶解曲线分析。程序的反应步骤：95 15 s；58 20 s， 在 20 min 内温度上升至 95 并维持 15 s。 7.4.5结果判定 阳性对照 Ct 值

17、小于或等于 30，有典型的扩增曲线，溶解曲线有明显的溶解温度；阴性对照和空 白对照无 Ct 值或 Ct 值大于 35，无扩增曲线，溶解曲线无明显的溶解温度，结果成立。 待测样品 Ct 值小于或等于 30，且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光 RT-PCR 结果阳性。 待测样品呈现无 Ct 值、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光 RT-PCR 结果阴性。 对于 Ct 值大于 30、小于 40 的样品，应重新调整模板浓度后重复实验。重复检测样品 Ct 值小于 或等于 30 且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光 RT-PCR 结果阳性，否则判为荧光 RT-PCR 阴 性反应。 7.5

18、IPNV 的 RT-PCR 检测 7.5.1设立对照 每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照可用 DEPC 水代替样品；阴性对照 为不含 IPNV 的组织或细胞培养物；阳性对照为含 IPNV 的阳性组织、细胞培养物或含目的片段的 RNA。 7.5.2RNA 抽提 分别取200 L待检样品组织上清液或待检样品细胞培养物，加入1 mL Trizol试剂，用移液器充分 吹打10次20 次，室温放置 5 min ；加入 200 L 三氯甲烷，旋涡振荡 30 s 混匀，室温放置 15 min ； 12 000 r/min 离心 10 min；取上层水相至一新的离心管中，加等体积异丙醇，上下

19、颠倒数次混匀，-20 放置 20 min ；12 000 r/min 离心 10 min ；弃上清液，沉淀用 1 mL 75乙醇清洗；8 000 r/min 离心 表1 （续） 以正式出版文本为准 5 SN/T 1162 2020 10 min，弃上清液，沉淀室温干燥 5 min ；加 20 L DEPC 水溶解 RNA 沉淀。4 冰箱保存备用， RNA 溶液应避免反复冻融，并尽快用于检测。 RNA 提取也可采用等效的商品化 RNA 提取试剂盒，代替以上方法。 7.5.3反应体系 在 0.2 mL PCR 反应管中，按表 2 配制反应体系，加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳 性对照的次序

20、分别加入模板，盖上管盖，充分混匀。 表 2IPNV RT-PCR 反应体系（25 L） 组分 加样量 / L 终浓度 10One Step RNA PCR Buffer 2.5 1 MgCl 2 （25 mmol/L） 5 5 mmol/L dNTPs（10 mmol/L each） 2.5 1 mmol/L RNase Inhibitor（40 U/ L） 0.5 0.8 U/L AMV RTase（5 U/ L） 0.5 0.1 U/L Taq DNA 聚合酶（5 U/ L） 0.5 0.1 U/L IPNV PrD1（20 mol/L） 0.5 0.4 mol/L IPNV PrD2（2

21、0 mol/L） 0.5 0.4 mol/L RNase Free dH 2 O 10 模板 / 对照 2.5 将已加样的 PCR 反应管短暂离心后 60 水浴 10 min，迅速转移到冰上，冰浴 5 min，瞬时离心。 然后放入PCR仪，扩增反应条件设定：42 反转录30 min，94 预变性2 min；94 变性15 s，58 退火 30 s，72 延伸 30 s，35 个循环；72 10 min，4 保存。 7.5.4电泳检测 用新鲜配制的 1TAE 电泳缓冲液配制 2 % 琼脂糖凝胶，采用 Goldview 或其他等效核酸染料，按 说明书使用。取适量扩增产物液进行电泳检测，设 DNA

22、Marker 同步电泳；采用 5 V/cm8 V/cm，电 泳 1 h，用凝胶成像仪或紫外透射仪观察，拍照记录检测结果。 7.5.5结果判定 在紫外观察灯上或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。阴性对照、空白对照应无特异扩增产 物，阳性对照应有分子量为 174 bp 的特异扩增产物。否则，本次实验无效。 在对照成立的条件下，如果待检样品出现分子量为 174 bp 的特异扩增产物，判为 RT-PCR 检测 阳性；如果没有出现特异扩增条带，判为 RT-PCR 检测阴性。 7.5.6RT-PCR 检测结果的确证 将 RT-PCR 阳性扩增产物克隆后测序，将所测得的扩增产物序列与 GenBank 收录的

23、 IPNV 序列进 行比较，序列吻合的表明确证为阳性，参考序列参见附录 C。 以正式出版文本为准 6 SN/T 1162 2020 7.6IPNV 的 ELISA 检测 7.6.1包被和封闭 将羊抗 IPNV 抗体用包被液（见附录 B 中 B.3）做适当稀释后包被酶标板，每孔 100 L，4 孵 育 12 h24 h 或者 37 反应 1.5 h2 h。倒出孔内液体，将 PBST （见附录 B 中 B.4）加满小孔，2 min 后倒出，拍干。如此重复 3 次。用封闭液（见附录 B 中 B.5）封闭，每孔 200 L，37反应 1 h。弃 去封闭液，用 PBST 洗 1 次，拍干后可现用，也可以

24、密封后在 -20 保存 23 个月。 7.6.2加样 每个样品两孔，每孔 100 L。另将含有 IPNV 参考毒株的细胞培养液（阳性对照）、含有其他病 毒的细胞培养液（阴性对照）和细胞培养液（空白对照）也各加两孔。37 反应 1.5 h2 h。倒出孔 内液体，用 PBST 洗 3 次。 7.6.3加入抗 IPNV 的抗血清 每孔加100 L稀释到工作浓度的兔抗IPNV参考抗血清（用细胞培养液稀释），37 反应1.5 h2 h。 倒出孔内液体，用 PBST 洗 2 次。 7.6.4去除非特异性的过氧化物酶 每孔加 0.1 L 0.1% 的 H 2 O 2 （用双蒸水稀释）。37 反应 15 mi

25、n 以去除非特异性的过氧化物酶。 倒出孔内液体，用 PBST 洗 2 次。 7.6.5加酶标二抗 每孔加 100 L 稀释到工作浓度的酶标羊抗兔 IgG（用细胞培养液稀释），37 反应 1.5 h2 h。 倒出孔内液体，用 PBST 洗 3 次。 7.6.6加底物显色 每孔加 100 L OPD 溶液（见附录 B 中 B.6），室温避光反应 10 min。 7.6.7终止反应 当阳性对照出现明显棕黄色、阴性对照无色时、立即每孔加入 200 L 浓度为 2 mol/L 硫酸终止 反应。 7.6.8结果判读 10 min 内判读结果。用酶标仪测量各孔在 490 nm 波长时的光吸收值（A 490

26、值）。以空白对照的 A 490 值为零点。先计算阳性对照孔的 A 490 值 （P）与阴性对照孔的 A 490 值（N）之比，即 P/N 值。当 P/N 值大于等于 2.1，表明对照成立。再计算待测样品孔和阴性对照孔的 A 490 值之比。当样品孔的 A 490 值（P）与阴性对照孔的 A 490 值（N）之比大于等于 2.1 （即 P/N 2.1） 时为阳性；当样品孔的 A 490 值（P） 与阴性对照孔的 A 490 值（N）之比小于 2.1 （即 P/N2.1） 时为阴性。 8综合判定 8.1出现下列的一种情况，判定为可疑病例： 出现典型临床症状； 样品接种敏感细胞，培养后出现典型 CP

27、E ； 以正式出版文本为准 7 SN/T 1162 2020 RT-PCR 或实时荧光 RT-PCR 结果阳性； ELISA 结果阳性。 8.2用下列两种方法检测，结果均为阳性的，判定为患传染性胰脏坏死病： 出现典型临床症状； 样品接种敏感细胞，培养后出现典型 CPE ； RT-PCR 或实时荧光 RT-PCR 结果阳性； ELISA 结果阳性。 以正式出版文本为准 8 SN/T 1162 2020 附录A （资料性） 传染性胰脏坏死病简介 传染性胰脏坏死病毒（infectious pancreatic necrosis virus, IPNV）是传染性胰脏坏死病（infectious pan

28、creatic necrosis, IPN）的病原，属双片段 RNA 病毒科双片段 RNA 病毒属。病毒颗粒呈六角形或近 似圆形的正20面体，无囊膜，直径约50 nm75 nm，有92个壳粒。主要危害溪鳟、虹鳟、大西洋鲑、 银大麻哈鱼等鲑科的鱼苗和幼鱼，20 周龄以上的幼鱼一般不发病。IPN 最早在北美和欧洲流行，20 世纪 80 年代传入朝鲜、我国台湾省及东北、山西、山东、甘肃等地。该病呈急性流行，死亡率高达 70%80%，且死亡率与引发该病的具体病毒株、鱼的种类、环境以及养殖条件相关。临床症状为体 色发黑、眼球突出、腹部膨大、腹部及鳍基部充血、鳃呈淡红色、肛门处常拖有条线状黏液便。IPN

29、常在水温 10 15 时流行。 以正式出版文本为准 9 SN/T 1162 2020 附录B （规范性） 试剂及其配制 B.1DEPC 水 每升去离子水中加入 1 mL DEPC，用力摇匀，使 DEPC 充分混匀在水中，37 放置 12 h，然后 121 15 min 高压灭菌后备用。 B.2细胞培养液 TC199培养基，按说明书的要求配制，然后加入10的胎牛血清，开放系统使用时，加入 HEPES，使其在培养液中的终浓度为 0.02 mol/L。抽滤除菌，-20 保存。 B.3包被液（pH 9.6） Na 2 CO 3 1.59 g NaHCO 3 2.93 g 水 1 000 mL 充分搅拌

30、溶解后，保存。 B.4PBST NaCl 8 g KCl 0.2 g KH 2 PO 4 0.2 g Na 2 HPO 4 12H 2 O 2.9 g 水 1 000 mL 吐温 -20 0.05 mL 摇匀后，保存。 B.5封闭液 明胶 1 g 包被液 100 mL 摇匀后，保存。使用前置于微波炉或者水浴中溶解明胶，降到室温后使用。 B.6底物 OPD 溶液（pH 5.0） 0.1 moL/L Na 2 HPO 4 600 mL 0.1 moL/L 柠檬酸 300 mL 混合成底物稀释液。在 100 mL 底物稀释液中溶入 80 mg 的邻苯二胺 （OPD），然后加入 80 L的 H 2 O

31、 2 ，放 5 min 不变色即可使用（使用前配制）。 以正式出版文本为准 10 SN/T 1162 2020 附录C （资料性） IPNV 扩增产物的参考序列 C.1SYBR Green 实时荧光 RT-PCR 扩增序列 TGTCCCTAACTACGAACCCCCAGGACAAAGCCAACAACCAGCTGGTGACCAAAGGAGTCACCGTCC TGAATCTACCAACAGGGTTCGACAAACCATACGTCCGCCTAGAGGACGAGACACCCCAGGGTCTCCA C.2RT-PCR 扩增序列 AAAGCCATAGCCGCCCATGAACAAGGGCTGCCACTCAT

32、CGGCAACCAACCAGGAGTGGACGAGGA GGTGCGAAACACATCCCTGGCCGCACACCTGATCCAGACCGGGACCCTGCCCGTACAACGCGCAAAGGG CTCCAACAAGAGGATCAAGTACCTGGGAGAGCTGATGGCA 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1 字数 30 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1500 书号：15517536 定价 18.00 元 传染性胰脏坏死病检疫技术规范 行 业 标 准 SN/T 11622020 * * * SN/T 1162 2020 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址