DB37 T 4363-2021 伪狂犬病毒与水貂肠炎病毒双重荧光PCR检测方法.pdf
《DB37 T 4363-2021 伪狂犬病毒与水貂肠炎病毒双重荧光PCR检测方法.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DB37 T 4363-2021 伪狂犬病毒与水貂肠炎病毒双重荧光PCR检测方法.pdf(9页珍藏版)》请在麦多课文档分享上搜索。
1、 ICS 11.220 CCS B 41 37 山东省 地方标准 DB 37/T 4363 2021 伪狂犬病毒与水貂肠炎病毒双重荧光 PCR 检测方法 Duplex real-time PCR detection method for pseudorabies virus and mink enteritis virus 2021 - 03 - 11 发布 2021 - 04 - 11 实施 山东省 市场监督管理局 发 布 DB 37/T 4363 2021 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 2020标准化工作导则 第 1部分:标准化 文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件
2、的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位:山东省动物疫病预防与控制中心、中华人民共和国北京海关检科院、威海市畜牧 业发展中心、山东省畜牧总站、青岛市动物疫病预防控制中心、淄博市张店区畜牧事业服务中心、山东 农业大学。 本文件主要起草人:王贵升、张鹤晓、尹斐斐、蔺晓月、李玉杰、赵国清、徐鸿、杨景晁、宋德武、 孙淑红、郭慧君、马慧玲、张华杰、姜 秀云。 DB 37/T 4363 2021 1 伪狂犬病毒与水貂肠炎病毒双重荧光 PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了伪狂犬
3、病毒与水貂肠炎病毒(水貂细小病毒)双重荧光 PCR检测方法。 本文件适用于伪狂犬病毒与水貂肠炎病毒的快速鉴别诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR:聚合酶链式反应 DNA:脱氧核糖
4、核酸 PBS:磷酸盐缓冲生理盐水 5 试剂或材料 5.1 除非另有说明,在检测中使用的试剂均为分析纯,水应符合 GB/T 6682要求。 5.2 细胞裂解液,配置见 A.5,于 2 8 保存。 5.3 蛋白酶 K溶液,配置见 A.6。 5.4 RNA酶溶液,配置见 A.7。 5.5 无水乙醇。 5.6 75 % 乙醇,配置见 A.8, -20 预冷。 5.7 氯仿, 4 预冷。 5.8 异丙醇, 4 预冷。 5.9 TE缓冲液,配制见 A.9。 5.10 阳性、阴性对照。 阳性对照:带有伪狂犬病毒 gB基因和水貂肠炎病 毒 VP2基 因的质粒。 阴性对照:为已知伪狂犬病毒和水貂肠炎病毒阴性的动
5、物组织悬液。 DB 37/T 4363 2021 2 6 仪器设备 6.1 双通道以上荧光 PCR检测仪及配套反应管(板)。 6.2 高速冷冻离心机,离心速度 13 000 r/min。 6.3 冰箱, 2 8 和 -20 两种。 6.4 微量移液器及配套吸头,量程规格应包含 5 L、 10 L、 100 L和 1 000 L。 6.5 无核酸酶的 1.5 mL离心管。 7 样品 7.1 采样工具 下列采样工具必须经 121 , 15 min高压灭菌并烘干: 棉拭子 ; 剪刀、镊子; 1.5 mL离心管; 研钵或组织研磨仪。 7.2 样品采集 7.2.1 拭子样品 有咽喉拭子样品和肛门拭子样品
6、: a) 咽喉拭子采样,采样时将拭子深入喉头来回刮 3次 5次取咽喉分泌液。然后将拭子插入装有 1.0 mL PBS的 1.5 mL 离心管中,加盖、编号备用; b) 肛门拭子采样,采样时将拭子深入肛门转一圈并沾取少量粪便;然后将拭子插入装有 1.0 mL PBS的 1.5 mL离心管中,加盖、编号备用。 7.2.2 组织样品 组织样品应用无菌剪刀、镊子采取具有明显病变的组织,装入一次性自封袋或其它灭菌容器,编号 备用。 7.3 样品贮运 样品采 集后,放入密闭的自封袋内(一个采样点的样品,放一个自封袋),于保温箱中加冰、密封, 24 h内送实验室。 7.4 样品处理 7.4.1 咽喉拭子或肛
7、门拭子 样品在混匀器上充分混匀后,用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出,室温放置 30 min,取上清液转 入无菌的离心管中,编号备用。 7.4.2 肌肉或组织脏器 取待检样品不少于 2.0 g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨,加 10 mL PBS混匀, 4 , 3 000 r/min 离心 15 min,取上清液转入无菌的 1.5 mL离心管中,编号备用。 或者用专用仪器设备处理待检组织样品。 DB 37/T 4363 2021 3 7.5 样品贮存 制备 的样品在 2 8 条件下保存不应超过 24 h,若长期保存应置 -70 以下,但应避免反复冻融 (冻融不超过三次)。 8 实验步骤 8.
8、1 实验室规范 荧光 PCR检测方法的实验室规范应符合 GB 19489和 GB/T 27401要求。 8.2 样品病毒核酸 DNA 提取 8.2.1 在样品处理区进行。在 1.5 mL的离心管中加入样品 上清液 200 L,加入 1.0 mL的 DNA提取细胞 裂解液, 25 L蛋白酶 K混匀, 56 水浴 2 h,期间不时轻微摇匀。加入 10 L RNA 酶, 37 酶解 1 h。 8.2.2 加入 200 L 的氯仿,盖紧离心管盖,用力震 荡离心管(溶液充分乳化,成乳白状,无分相现 象),室温放置 10 min。 8.2.3 4 离心、 13 000 r/min、 15 min,取上层液
9、相移入另一管(切忌吸动白色中间相)。 8.2.4 加入等体积异丙醇,轻轻颠倒离心管充分混匀液体,室温放置 10 min。 8.2.5 离心 4 、 13 000 r/min、 15 min,用移液器 小心吸去所有上清。 8.2.6 加 1.0 mL 75 %乙醇洗一遍,离心 4 、 8 000 r/min、 10 min,用移液器 小心吸 去所有上清,重 复洗涤一次,在超净台中干燥 5 min。 8.2.7 加入 50 L TE缓冲液溶解 DNA, -20 保存备用。 8.2.8 可采用经验证的病毒 DNA提取试剂盒,按照试剂盒使用说明书提取 DNA。 8.3 荧光 PCR 扩增 8.3.1
- 1.请仔细阅读文档,确保文档完整性,对于不预览、不比对内容而直接下载带来的问题本站不予受理。
- 2.下载的文档,不会出现我们的网址水印。
- 3、该文档所得收入(下载+内容+预览)归上传者、原创作者;如果您是本文档原作者,请点此认领!既往收益都归您。
下载文档到电脑,查找使用更方便
5000 积分 0人已下载
下载 | 加入VIP,交流精品资源 |
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- DB37 4363-2021 伪狂犬病毒与水貂肠炎病毒双重荧光PCR检测方法 4363 2021 狂犬病毒 水貂 肠炎 病毒 双重 荧光 PCR 检测 方法
