1、 ICS 11.220 CCS B 41 37 山东省 地方标准 DB 37/T 4363 2021 伪狂犬病毒与水貂肠炎病毒双重荧光 PCR 检测方法 Duplex real-time PCR detection method for pseudorabies virus and mink enteritis virus 2021 - 03 - 11 发布 2021 - 04 - 11 实施 山东省 市场监督管理局 发 布 DB 37/T 4363 2021 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 2020标准化工作导则 第 1部分：标准化 文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件
2、的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心、中华人民共和国北京海关检科院、威海市畜牧 业发展中心、山东省畜牧总站、青岛市动物疫病预防控制中心、淄博市张店区畜牧事业服务中心、山东 农业大学。 本文件主要起草人：王贵升、张鹤晓、尹斐斐、蔺晓月、李玉杰、赵国清、徐鸿、杨景晁、宋德武、 孙淑红、郭慧君、马慧玲、张华杰、姜 秀云。 DB 37/T 4363 2021 1 伪狂犬病毒与水貂肠炎病毒双重荧光 PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了伪狂犬
3、病毒与水貂肠炎病毒（水貂细小病毒）双重荧光 PCR检测方法。 本文件适用于伪狂犬病毒与水貂肠炎病毒的快速鉴别诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链式反应 DNA：脱氧核糖
4、核酸 PBS：磷酸盐缓冲生理盐水 5 试剂或材料 5.1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，水应符合 GB/T 6682要求。 5.2 细胞裂解液，配置见 A.5，于 2 8 保存。 5.3 蛋白酶 K溶液，配置见 A.6。 5.4 RNA酶溶液，配置见 A.7。 5.5 无水乙醇。 5.6 75 % 乙醇，配置见 A.8， -20 预冷。 5.7 氯仿， 4 预冷。 5.8 异丙醇， 4 预冷。 5.9 TE缓冲液，配制见 A.9。 5.10 阳性、阴性对照。 阳性对照：带有伪狂犬病毒 gB基因和水貂肠炎病 毒 VP2基 因的质粒。 阴性对照：为已知伪狂犬病毒和水貂肠炎病毒阴性的动
5、物组织悬液。 DB 37/T 4363 2021 2 6 仪器设备 6.1 双通道以上荧光 PCR检测仪及配套反应管（板）。 6.2 高速冷冻离心机，离心速度 13 000 r/min。 6.3 冰箱， 2 8 和 -20 两种。 6.4 微量移液器及配套吸头，量程规格应包含 5 L、 10 L、 100 L和 1 000 L。 6.5 无核酸酶的 1.5 mL离心管。 7 样品 7.1 采样工具 下列采样工具必须经 121 ， 15 min高压灭菌并烘干： 棉拭子 ； 剪刀、镊子； 1.5 mL离心管； 研钵或组织研磨仪。 7.2 样品采集 7.2.1 拭子样品 有咽喉拭子样品和肛门拭子样品
6、： a) 咽喉拭子采样，采样时将拭子深入喉头来回刮 3次 5次取咽喉分泌液。然后将拭子插入装有 1.0 mL PBS的 1.5 mL 离心管中，加盖、编号备用； b) 肛门拭子采样，采样时将拭子深入肛门转一圈并沾取少量粪便；然后将拭子插入装有 1.0 mL PBS的 1.5 mL离心管中，加盖、编号备用。 7.2.2 组织样品 组织样品应用无菌剪刀、镊子采取具有明显病变的组织，装入一次性自封袋或其它灭菌容器，编号 备用。 7.3 样品贮运 样品采 集后，放入密闭的自封袋内（一个采样点的样品，放一个自封袋），于保温箱中加冰、密封， 24 h内送实验室。 7.4 样品处理 7.4.1 咽喉拭子或肛
7、门拭子 样品在混匀器上充分混匀后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置 30 min，取上清液转 入无菌的离心管中，编号备用。 7.4.2 肌肉或组织脏器 取待检样品不少于 2.0 g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加 10 mL PBS混匀， 4 ， 3 000 r/min 离心 15 min，取上清液转入无菌的 1.5 mL离心管中，编号备用。 或者用专用仪器设备处理待检组织样品。 DB 37/T 4363 2021 3 7.5 样品贮存 制备 的样品在 2 8 条件下保存不应超过 24 h，若长期保存应置 -70 以下，但应避免反复冻融 （冻融不超过三次）。 8 实验步骤 8.
8、1 实验室规范 荧光 PCR检测方法的实验室规范应符合 GB 19489和 GB/T 27401要求。 8.2 样品病毒核酸 DNA 提取 8.2.1 在样品处理区进行。在 1.5 mL的离心管中加入样品 上清液 200 L，加入 1.0 mL的 DNA提取细胞 裂解液， 25 L蛋白酶 K混匀， 56 水浴 2 h，期间不时轻微摇匀。加入 10 L RNA 酶， 37 酶解 1 h。 8.2.2 加入 200 L 的氯仿，盖紧离心管盖，用力震 荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现 象），室温放置 10 min。 8.2.3 4 离心、 13 000 r/min、 15 min，取上层液
9、相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。 8.2.4 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置 10 min。 8.2.5 离心 4 、 13 000 r/min、 15 min，用移液器 小心吸去所有上清。 8.2.6 加 1.0 mL 75 %乙醇洗一遍，离心 4 、 8 000 r/min、 10 min，用移液器 小心吸 去所有上清，重 复洗涤一次，在超净台中干燥 5 min。 8.2.7 加入 50 L TE缓冲液溶解 DNA， -20 保存备用。 8.2.8 可采用经验证的病毒 DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取 DNA。 8.3 荧光 PCR 扩增 8.3.1
10、扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行。设所需 PCR管 数为 n（ n=样本数 +1管阴性对照 +2管阳性对照），每个测试 反应体系需要 20 L荧光 PCR反应液。按 B.2配制反应液，为避免移液器取样损失，建议按 n+1个反应配 制，计算好各试剂的使用量，加入一适当体积 小管中，充分混合均匀后，向每个 PCR管中各分装 20 L， 转移至样品处理区。 8.3.2 加样 在样品处理区进行。分别向上述 PCR管中加入样本核酸提取步 骤 8.2.7中 制备的 DNA溶液各 5 L，盖 紧管盖， 500 r/min离心 30秒，转移至检测区。 8.3.3 荧光 PCR 反应 在检测区进行。将加样后
11、的 PCR管放入荧光 PCR检测仪内，记录 PCR管摆放顺序。反应参数设置：第 一阶段，预变性 94 /3 min；第二阶段， 94 /15 sec， 60 /60 sec共 40个循环。最后 40 2 min。荧 光收集在第二阶段每次循环的 60 延伸时进行。 9 结果判定 9.1 结果分析条件的设定 DB 37/T 4363 2021 4 阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。 对于多通道荧光 PCR仪，选定 FAM检测通道读取伪狂犬病毒检测结果，选定 Cy5检测通道读取水貂细小病 毒检测结果，淬灭基团选无荧光基团。 9.2 质控标准 9.
12、2.1 阴性对照无 Ct值并且无扩增曲线。 9.2.2 阳性对照的 Ct值应小于等 28，并出现典型的扩增 曲线 ， 曲线图样见 附录 C。 9.2.3 如阴性和阳 性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。 注： Ct值，每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。 9.3 结果判定 9.3.1 阴性 双检测通道均无 Ct值，且无特征性扩增曲线 ，表明样品中无伪狂犬、水貂细小病毒核酸。 9.3.2 阳性 9.3.2.1 双阳性：双检测通道 Ct值均 30.0，且均出现典型的扩增曲线，表示样品中存在伪狂犬、水 貂细小病毒的核酸。 9.3.2.2 单阳性： 如仅 FAM检测通道出现特征
13、性扩增曲线，且 Ct 值 30.0，而 Cy5检测通道无 Ct值并且无扩 增曲线，表示样品中存在伪狂犬病毒核酸； 如仅 Cy5检测通道出现特征性扩增曲线，且 Ct 值 30.0，而 FAM检测通道无 Ct值并且无扩 增曲线，表示样品中存在水貂细小病毒核酸。 9.3.3 可疑 任一通道 Ct值在 30.0 38.0区间，且出现典型的扩增曲线的样品，建议复验。复 验仍出现上述结果 的，判为阳性，否则判为阴性。 DB 37/T 4363 2021 5 A A 附录 A （资料 性） 溶液配制 A.1 0.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液 称取 6.055 g Tris置于 100
14、 mL烧杯中，加入 80 mL水，用浓 HCl调节 pH值至 8.0，定容至 100 mL，高压 灭菌后室温保存待用。 A.2 0.5 mol/L EDTA（ pH 8.0）溶液 称取 18.61 g Na2EDTA 2H2O置于 100 mL烧杯中，加入 80 mL水，用 10 %的 NaOH溶液，调节 pH值至 8.0， 定容至 100 mL，高压灭菌后室温保存 待用。 A.3 10 % SDS 称取 10 g SDS溶解于 80 mL灭菌水中，定容至 100 mL。储存于灭菌过的容器中待用。 A.4 5 mol/L NaCl 溶液 称取 29.25 g NaCl溶解于 80 mL水中，定
15、容至 100 mL，高压灭菌后室温保存待用。 A.5 细胞裂解液 取 0.5 M Tris-HCl（ PH8.0） 40 mL， 0.5 M EDTA（ pH8.0） 5 mL， 5.0 M NaCl 10 mL， 10 % SDS 5 mL， 定容至 100 mL。 A.6 20 mg/mL 蛋白酶 K 溶液 准确称量 0.2 g蛋白酶冻干品，加水 溶解，定容至 10 mL，分装后于 -20 保存。 A.7 RNA 酶溶液 将 1 g冻干品 RNA酶 A溶于 6 mL无菌水中，于 100 加热 15 min，缓慢冷却至室温，定容至 10 mL，分装 成小份存于 -20 。 A.8 75 %
16、乙醇 量取 75 mL无水乙醇，加入 25 mL水。 A.9 TE 缓冲液 将 0.5 mL的 10 mmol Tris-HCl(pH8.0)、 0.1 mL的 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)加入到容量瓶中，调 pH8.0， 加 ddH2O水定容至 50 mL，高压灭菌后，降至室温， 4 保存备用。 DB 37/T 4363 2021 6 B B 附录 B （资 料性） 引物探针序列及荧光 PCR 反应液配方 B.1 引物和探针 引物和探针序列表见表 B.1。 表 B.1 引物和探针序列表 病毒名称 序列名称 序列 伪狂犬病毒 上游引物 GCCAACCCGCTCGTGCTC 下游引
17、物 CACGAACACGCAGTCGCAGTA 探针 FAM-GGCAGGTGCTGGGACTCGGGC- BHQ1 水貂肠炎病毒 上游引物 CGTCTACACAAGGGCCATTTA 下游引物 CCATGTTGTCTACCAAATGCAT 探针 Cy5-CGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCA-BHQ3 B.2 荧光 PCR 反应液配方 荧光 PCR反应液配方见表 B.2。 表 B.2 荧光 PCR 反应液配方 组分 1 个检测体系的加入量 5 PCR 缓冲液 5.0 L Taq 酶 (5 U/L ) 0.5 L dNTPs(10 mmol/L) 1.0 L MgCl2(25 m
18、mol/L) 3.0 L 伪狂犬病毒上游引物 (10 mol/L) 0.5 L 伪狂犬病毒下游引物 (10 mol/L) 0.5 L 伪狂犬病毒探针 (10 mol/L) 0.5 L 水貂肠炎病毒上游 引物 (10 mol/L) 0.5 L 水貂肠炎病毒下游引物 (10 mol/L) 0.5 L 水貂肠炎病毒探针 (10 mol/L) 0.5 L ddH2O 7.5 L 合计 20 L 注： Taq酶， Taq DNA 聚合酶。 DB 37/T 4363 2021 7 C C 附录 C （资料性） 对照样品检测结果曲线图 伪狂犬病毒阳性对照检测结果曲线图见图 C.1。 图 C.1 伪狂犬 病毒阳性 对照曲线 图 水貂细小病毒阳性对照检测结果曲线图见图 C.2。 图 C.2 水貂细小病 毒阳性对照曲线图
