DB34 T 3642-2020 鸡滑液囊支原体LAMP快速检测技术规程.pdf

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1、ICS 11.220 B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 36422020 鸡滑液囊支原体 LAMP 快速检测技术规程 Technical Regulations of LAMP Assay for Rapid Detection of Mycoplasma Synoviae 文稿版次选择 2020 - 06 - 22 发布 2020 - 07 - 22 实施 安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 36422020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由阜阳市畜牧兽医局提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：

2、阜阳市立华畜禽有限公司、阜阳市动物疫病预防与控制中心、颍东区动物疫病预 防与控制中心、安徽省动物疫病预防与控制中心、萧县畜牧兽医水产服务中心。 本标准主要起草人：张海涛、孟宪臣、洪功飞、李维民、王晓晖、靳宇田、郑玉才、罗燕、薛亚梅、 丁平云、张明飞、梁静、刘新、马群山、牛洪波、张娟娟。 DB34/T 36422020 1 鸡滑液囊支原体 LAMP 快速检测技术规程 1 范围 本标准规定了鸡滑液囊支原体LAMP检测主要仪器、主要试剂、引物、样品的采集和处理、检测步骤。 本标准适用于鸡滑液囊支原体LAMP的实验室检测、临床快速可视化检测和筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可

3、少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 MS（Mycoplasma Synoviae）：鸡滑液囊支原体 LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification Assay）：环介导等温扩增 4 主要仪器 4.1 高速台式冷冻离心机（最大转速 15000 rpm） 4.2 生物安全通风橱 4.3 微量移液器（10 L、100 L、1000 L） 4.4 -80超低温冰箱 4.5 高压蒸汽灭

4、菌锅 4.6 电热恒温水槽（室温100） 4.7 微量振荡器 4.8 电泳仪 4.9 电热恒温鼓风干燥箱 4.10 pH 计 5 主要试剂 5.1 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH 8.0） 三羟甲基氨基甲烷 12.11 g，灭菌双蒸水 80 mL，浓盐酸调 pH 至 8.0，灭菌双蒸水加至 100 mL。 5.2 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0） DB34/T 36422020 2 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61 g， 灭菌双蒸水 80 mL， 氢氧化钠调 pH 至 8.0， 灭菌双蒸水加至 100 mL。 5.3 20十二烷基硫酸钠（SDS

5、）溶液（pH 7.2） 十二烷基硫酸钠 20 g，灭菌双蒸水 80 mL，浓盐酸调 pH 至 7.2，灭菌双蒸水加至 100 mL。 5.4 消化液 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH 8.0）2 mL，0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0）0.4 mL，20十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（pH 7.2） 5 mL，5 mol/L 氯化钠 4 mL，灭菌双蒸水 加至 200 mL。 5.5 2蛋白酶 K 溶液 蛋白酶K（分析纯）5 g，灭菌双蒸水加至 250 mL。 5.6 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液 碱性酚 25 mL，三氯甲烷 24 mL，异戊醇 1

6、mL。 5.7 PBS（磷酸盐缓冲液） 5.8 双蒸水（符合 GB/T 6682 的要求） 5.9 Bst DNA Polymerase 试剂盒 5.10 DL2000 DNA Marker 5.11 6Loading Buffer 6 引物 按照 GenBank 上公布的鸡滑液囊支原体（MS）EF-TU基因序列（登录号CP011096），应用 PrimerExplorer V4设计引物，引物序列如下： F3：5- CACAAATGGATGGTGCTATTCTT -3 B3：5-TACTGCGTCACCTTCAAGTGCT-3 FLP：5-CGTGAACACATTCTTCTTTCAAAAC-3

7、 BLP：5- ATCCGTATTCTGATAATAGATCACG-3 FIP：5- TTGTTTAGGAAAACCACCATTCTTGGTGCAACAGATGGGCCTATG-3 BIP：5- ACGAAGAAATGATTGGGCTTGTTGCCTCTAACGATAGGAGCGTTGTC-3 双蒸水溶解后分装，-20冰箱保存备用。 7 样品的采集和处理 7.1 样品采集和储运 无菌采集咽喉拭子，关节囊肿和胸部囊肿的内部炎性分泌物，放入盛有 1.0 mL PBS 溶液（高压冷 却后的 PBS 溶液，无菌条件下加入青霉素 1000 IU/mL）的 1.5 mL 离心管中，加盖标记。 样品采集后，

8、放入密闭的塑封袋内（一个采样点的样品，放在一个塑封袋内），标记后封存于加有 冰袋的保温箱内，24 h 内进行样品处理。 7.2 样品处理 DB34/T 36422020 3 样品在震荡器上充分混合后，反复冻融 3 次，将全部溶液转入无菌的 1.5 mL 离心管，编号备用。 7.3 处理后的样品存放 制备的样品在 28条件下保存应不超过 24 h，如需长期保存应置 -70以下，应避免反复冻 融。 8 检测步骤 8.1 核酸提取 8.1.1 取n个灭菌的1.5 mL 离心管，其中 n 为被检样品、阳性对照和阴性对照数量之和，编号。其中 阳性对照样品为 PCR 鉴定为 MS 的病料或阳性病料接种培养

9、基后获得的 MS 纯培养物， 阴性对照样品为灭 菌双蒸水。 8.1.2 每管加入待检样品（已研磨好的被检样品上清，阳性对照样品和阴性对照样品）100 L，加入 500 L消化液和10 L 2蛋白酶 K 溶液，混匀，置 55水浴中 30 min。 8.1.3 每管加入 600 L 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液，用力颠倒 10 次混匀，12000 rpm 离心 10 min。 8.1.4 取上清 500 L 置 1.5 mL 灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，置 -80冰箱中 30 min， 取出离心管，室温融化，4，12000 rpm 离心 15 min。 8.1.5 弃上清，沿离心管开口方向

10、管壁缓缓滴入 1 mL -20预冷的 75乙醇溶液，轻轻旋转洗一次 后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上 1 min，置 37干燥箱干燥 30 min。 8.1.6 取出离心管，用 50 L 灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用。若需长期保存须放置在 -80冰 箱。 8.2 扩增 8.2.1 扩增试剂准备 从 Bst DNA Polymerase 试剂盒中取出相应的试剂，同时取出 MS LAMP 引物和双蒸水。 设所需 PCR的检测总数为 n，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对 照之和，每个样本测试反应 体系配制见表1。 表1 每个样本测试反应体系配置表 试剂 用量 /L 终浓度 10ThermoP

11、ol buffer 2.5 1（含 2 mM MgSO 4） MgSO4（100 mM） 1.5 6 mM（总量 8 mM） dNTP Mixture（10 mM） 3.5 1.4 mM/每种 FIP/BIP引物 1 1.6 M F3/B3引物 1 0.2 M FLP/BLP引物 1 0.4 M Bst DNA聚合酶 1 320 U/mL DNA模板 2 10 个拷贝数或更多 灭菌双蒸水 补至 25 8.2.2 加样 DB34/T 36422020 4 在各设定的 PCR 管中分别加入 8.1.6 中制备的 DNA 溶液各 2 L，瞬时离心 35 s。 8.2.3 LAMP 反应 将 8.2.

12、2 中离心后的 PCR 管编号，放入 65水浴锅内 3060 min，之后置 80温育 20 min 失活。 8.2.4 结果观察 8.2.4.1 每个样本取 9 L 的 LAMP 产物，加入 1 L 的 10 Loading buffer，混匀后，吸取 10 L 样品加入配制好的琼脂糖凝胶中，同时加入 DL2000 DNA Marker，之后在电压 100 V 下，经 1530 min 电泳，将凝胶放入凝胶成像系统中进行观察，并拍照记录（参见附录 A）。 8.2.4.2 阳性对照反应管有梯状目的条带，阴性对照无条带，实验成立。 8.2.4.3 检测样品出现与阳性对照相同梯状条带的判断为阳性，即该样品的 MS 核酸呈阳性，反之则 为阴性。 DB34/T 36422020 5 A A 附 录 A （资料性附录） MS 的 LAMP 产物琼脂凝胶电泳检测 MS 的 LAMP 产物琼脂凝胶电泳检测见图A.1。 图中： M：DL2000 Marker； 1：阳性对照样品； 2：鸡新城疫、传染性支气管炎病毒核酸 cDNA； 3：鸡马立克病毒核酸； 4：鸡痘病毒核酸； 5：血清4型禽腺病毒核酸； 6：检测样品。 表A.1 MS 的 LAMP 产物琼脂凝胶电泳图 _