GA T 1635-2019 法庭科学 毛发、血液中吗啡和单乙酰吗啡检验 气相色谱-质谱法.pdf

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1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 毛发、血液中吗啡和单乙酰吗啡 检验 气相色谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for morphine and acetylmorphine in hair and blood samples GC-MS - -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标

2、准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC 179/SC1） 提出并 归口。 本标准 起草单位： 公安部物证鉴定中心、 中国人民公安大学 、重庆市公安局物证鉴定中心、上海市 公安局刑事科学技术研究管理中心。 本标准 主要 起草人 ： 张云峰、 常靖、刘耀、孟品佳、朱军、于忠山、崔巍、王俊伟、张玉荣、王绘 军、张潮、张松、张忠、罗敬峰、王立 春。 GA/T 1 法庭科学 毛发 、 血液中吗啡 和 单乙酰吗啡 检验 气相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了法庭科学毛发、血液中 吗啡和单乙酰吗啡 的 气相色谱 -质谱（ GC-MS） 定性定量 检验 方法。 本标准适用于

3、法庭科学 毛发 、 血液 中吗啡和 单乙酰吗啡 的 定性分析和定量分析。 其他可疑 样品 中 吗 啡和单乙酰吗啡 的 定性分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对毛发、血液样品进行提取、净化、浓缩 及 衍 生化， 采用 气

4、相色谱 -质谱 法 定性定量， 以目标物各组分 或各目标物的 衍生化产物的 保留时间 、质谱特 征离子碎片峰 和 相对丰度比 作为定性判断依据； 以 峰面积 为依据 ， 采 用外标法或内标法进行定量分析。 5 试剂 和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的三级水。在分析中使用的试 剂均为分析纯，试剂包括： a) 甲醇； b) 乙腈； c) 甲酸； d) 三氯甲烷 ； e) 异丙醇； f) 正庚烷； g) 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 （ pH 值 6.0） ： 1) 0.2mol/L 磷酸二氢钾 溶液 ：称取 2.72g KH2PO4，用水溶液并稀释至 100mL；

5、 2) 0.2 mol/L 氢氧化钠溶液 ： 称取 0.8g 氢氧化钠 ，用水溶解并 稀释 至 100mL； GA/T 2 3) 0.1mol/L 磷酸二氢钾（ KH2PO4） 缓冲液 （ pH 值 6.0）：量取 10mL 0.2 mol/L 磷酸二氢钾 溶液 与 1.0mL 0.2 mol/L 氢氧化钠 溶液 ， 混匀，加水 9mL， 混匀， 用 0.1mol/L 氢氧化钠 溶液或 0.1 mol/L HCl 溶液调 pH 值 至 6.0； h) 0.5mol/L Tris 缓冲液 （ pH 值 6.2） ； i) N-甲基 -双三氟乙酰胺（ MBTFA）； j) N-甲基 -N-三甲基硅

6、烷基三氟乙酰胺（ MSTFA）； k) N-O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（ BSTFA）； l) 标准溶液： 1） 1.0mg/mL 标准物质溶液： 根据 吗啡 和 单乙酰吗啡 标准物质的纯度和盐型换算后， 称取适 量 ， 分别 用甲醇配制 1.0mg/mL 吗啡和单乙酰吗啡 标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。 有效期 6 个月。或采用市售标准溶液； 2） 0.05mg/mL 单一 标准 工作 溶 液： 移取 1.0mg/mL 吗啡或单乙酰吗啡 标准物质溶液 各 0.5mL， 用甲醇稀释并定容至 10mL， 得到浓度 为 0.05mg/mL 吗啡和单乙酰吗啡的 单一 标准 工作 溶 液 ，置于冰

7、箱中冷藏保存。 有效期 3 个月。实验中所用其他浓度的单一标准工作 溶 液均由 0.05mg/mL 标准 工作 液用甲醇稀释得到； 3） 1.0mg/mL 内标溶液：根据 吗啡 -D3 内标 或乙基吗啡 内标物 的纯度和盐型换算后， 称取适量 ， 用甲醇配制 1.0mg/mL 吗啡 -D3 或乙基吗啡 内标 溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个 月。 或采用市售标准溶液； 4） 0.05mg/mL 内标 工作 溶液 ： 移取 1.0mg/mL 内标 溶液 0.5mL，用甲醇稀释并定容至 10mL， 得到 浓度为 0.05mg/mL 吗啡 -D3 或乙基吗啡的内标工作溶液 ，置于冰箱中冷藏保

8、存。有效 期 3 个月 。 实验中所用其他浓度的 内标 溶液均由 0.05mg/mL 内标 工作 溶液用甲醇稀释得 到 。 注 ： 特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。 5.2 材料 材料包括： a) 具盖离心管； b) 具塞玻璃试管 ； c) 烧杯； d) 固相萃取柱： Oasis MCX 固相萃取 柱或 其他 等效固相萃取柱 ，使用前 依次用甲醇 、 pH 值 6.0 的磷酸盐缓冲液 活化 。 注： OasisMCX柱是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 6 仪器和设备

9、 仪器和设备包括： a) 气相色谱 -质谱仪：配有电子轰击 源（ EI）； b) 离心机； c) 电子天平； d) 振荡器； e) 研磨仪； f) 移液器； GA/T 3 g) 超声波清洗器； h) 浓缩器； i) 烘箱 ； j) 微波炉。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品 提取 7.1.1.1 毛发 样品 7.1.1.1.1 毛发 清洗 称 取 毛发检材样品 约 200mg， 剪成长 度 约 为 2cm 的 碎段，置 于 小烧杯中，依 次用 甲醇 10mL、水 10mL、 甲醇 10mL 振荡 清洗 2min， 清洗 3 次以上， 自然晾干，于干净铝箔纸内密封后冷藏保存。同时

10、， 收集最后 一次 清洗毛发的甲醇溶液， 置于 浓缩器上浓缩至干， 残留物按 7.1.1.1.5 进行 衍生 ，供 GC-MS 分析，结果呈阴性证明毛发外部无污染，否则重新清洗毛发，直至最后清洗溶液呈阴性。 7.1.1.1.2 毛发水解 将 晾干后 的毛发 样品用研磨仪研碎， 铰碎至 1mm 2mm 左右，称取 50mg， （ 若采用内标法，则 加入 0.05mg/mL 吗啡 -D3 或乙基吗啡内标物 工作溶液 2L，混匀 ） ， 加入甲醇 1mL， 60 下超声水解 2h。 7.1.1.1.3 液液提取 取 7.1.1.1.5 水解后的毛发冷却至室温， 调 pH 值 9.0，加入 三氯甲烷

11、/异丙醇 /正庚烷 （体积比 50:17:33） 混合溶剂 8mL，混匀 ， 超声 10min， 8000r/min 离心 10min， 分离 有机相， 置于浓缩器上 45浓缩至干 ， 残留物按 7.1.1.1.5 进行 衍生 。 7.1.1.1.4 固相萃取 取 7.1.1.1.5 水解后的毛发冷却至室温 ， 加入 pH 值 6.0 的 磷酸盐 缓冲液 3mL， 8000r/min 离心 10min， 取上清液 转移至 活化好的固相萃取柱中 ， 控制流速 为 0.5mL/min 过柱 ， 依次用水 1mL、 0.1mol/L 盐酸 溶液 1mL、 甲醇 1mL 淋洗， 弃去淋洗液， 挤干水分

12、或离心或真空抽固相萃取柱 2min，用 二氯甲烷 /异 丙醇 /氨水（体积比 为 80:20:5） 混合溶剂 3mL 洗脱， 收集洗脱液并 置于浓缩器上浓缩至干 ，残留物 按 7.1.1.1.5 进行 衍生 。 7.1.1.1.5 衍生化 取 7.1.1.1.3 和 7.1.1.1.4 中待衍生残留物 ， 加乙酸乙酯 80L， MBTFA 或 MSTFA20L，混匀， 在微 波炉功率为 450W 下加热 2min（ 或于 60烘箱中加热 30min） ， 冷却至室温 ， 作为检材样品衍生液， 供 GC-MS 分析。 7.1.1.1.6 毛发 质控样品制备 取 清洗 晾干 后的 等量 空白毛发

13、两 份 于具盖离心管中 ，一份 作为 空白样品 ，一 份添加 吗啡、单乙酰吗 啡标准 物质作为添加样品（添加样品的浓度为 2ng/mg） ， 作为添加样品与 检材平行操作，得到空白样 GA/T 4 品衍生液和添加样品衍生液供仪器分析。 若采用内标法，可不做添加样品，空白样品（不加内标）与检材平行操作，同时 做 内标物质 和 标准 物质的衍生化， 供 仪器 分析 。 7.1.1.2 血液 提取 7.1.1.2.1 液液萃取 移 取 血液检材样品 1.0mL 于具盖离心管 中 ， （ 若采用内标法，则加入 内标 吗啡 -D3 或乙基吗啡内标 物 工作溶液 ，使其浓度为 100ng/mL， 混匀 ）

14、 ， 加入 0.1mol/LpH 值 6.0 磷酸盐缓冲液 1mL，混匀；加入 三氯甲烷 /异丙醇 /正庚烷（体积比 50:17:33）混合溶剂 8mL，混匀 ， 超声 10min， 8000r/min 离心 10min， 分离 有机相， 置于 浓缩器上浓缩至干 ， 残留物用甲醇 100L 溶解， 8000r/min 离心 5min， 残留物 按 7.1.1.1.5 进行 衍生 。 7.1.1.2.2 固相萃取 移取血液检材样品 1.0mL 于具盖离心管中， （若采用内标法，则加入 内标吗啡 -D3 或乙基吗啡内标 物工作溶液，使其浓度为 100ng/mL，混匀）， 加入 pH 值 6.0 的

15、磷酸盐缓冲液 3mL， 8000r/min 离心 10min， 取上清液 转移至 活化好的固相萃取柱 （ 依次用甲醇 1mL， 水 1mL 活化 ） 中 ， 控制上清液过柱，流速为 0.2mL/min 0.5mL/min， 依次用水 1mL、 0.1mol/L 盐酸溶液 1mL、 甲醇 1mL 依次 淋洗，抽干弃去淋洗 液， 挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱 2min，用 二氯甲烷 /异丙醇 /氨水（体积比 80:20:5）混合溶剂 3mL 洗脱， 流速为 1mL/min 2mL/min， 收集洗脱液并 置于浓缩器上浓缩至干，残留物 按 7.1.1.1.5 进行 衍生 。 7.1.1.2.3

16、衍生化 取 7.1.1.2.1 和 7.1.1.2.2 的 残留物 ， 按 7.1.1.1.5 进行衍生 。 7.1.1.2.4 血液 质控样品制备 取等量空白血液 两 份 于具盖离心管中， 一份作为空白样品， 一份添加吗啡、单乙酰吗啡标准工作溶 液 作为添加样品 （添加样品浓度为 100ng/mL） 与 检材平行操作，得到空白样品 衍生液 和添加样品 衍生 液 供仪器分析 。 若采用内标法，可不做添加样品，空白样品（不加内标）与检材平行操作，同时 做 内标物质 和 标准 物质 的衍生化， 供 仪器 分析 。 7.1.2 仪器 检测 7.1.2.1 仪器条件 （ 气相色谱 -质谱 条件） 以下

17、为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱 ： DB-5MS 毛细色谱柱 （ 30m0.25mm0.25m） 或等效色谱柱； 注 ： DB-5MS 为 Agilent 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的 认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 色谱柱温程： 150保持 1min，以 20/min 速率升温至 250，保持 2.5min，以 30/min 速 率升温至 285，保持 3min； c) 载气 ： 高纯 氦 ； d) 柱流量 ： 1mL/min； e) 进样口温度 ： 280； f

18、) 进样方式 ： 不分流 进样 ； GA/T 5 g) 检测器温度： 230； h) 电子 轰击 能量： 70eV； i) 离子源温度： 250 ； j) 扫描方式： 全扫描（ SCAN） ， 或选择离子 监测 （ SIM） 。 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品衍生液及标准工作溶液 衍生液 ，按 7.1.2.1的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品 提取 7.2.1.1 毛发样品 称取 清洗并 晾干的 毛发 检材样品 20mg 两份，（ 若采用内标法，则加入 内标 吗啡 -D3 或乙基吗啡内标 物 工作溶液 100ng， 混匀 ），按 7.1.1.1.27.

19、1.1.1.5 操作。当样品中目标物含量较低时，可适当加大样品 用量。 另取 清洗晾干后的 等量空白毛发样品三份， 其中两份 分别添加 吗啡、单乙酰吗啡 标准物质作为添加 样品 （添加样品中目标物含量应为检材样品中目标物含量的 (10030)%，若采用内标法，则添加样品中 还需加入 内标 吗啡 -D3或乙基吗啡 100ng，混匀） ，另一份作为空白样品， 与检材平行操作，得到空白样 品衍生液和添加样品衍生液供仪器分析。 7.2.1.2 血液 样品 移取血液检材样品 1.0mL 两份，（ 若采用内标法，则加入 内标 吗啡 -D3 或乙基吗啡内 100ng，混匀 ）， 按 7.1.1.2 操作。当

20、样品中目标物含量较低时，可适当加大样品用量。 另取等量空白血液样品三份， 其中两份 分别添加 吗啡、单乙酰吗啡 标准物质作为添加样品 （添加样 品中目标物含量应为检材样品中目标物含量的 (10050)%，若采用内标法，则添加样品中还需加入 内标 吗啡 -D3或乙基吗啡 100ng，混匀） ，另一份作为空白样品， 与检材 平行操作，得到空白样品衍生液和 添加样品衍生液供仪器分析。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品衍生液及标准工作溶液衍生液，按 7.1.2.1 分析条件每个样品进样 分析 2 3

21、次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 7.2.3.1.1 外标 -单点法 记录各样品 或衍生液 平行进样 2 3 次的目标物保留时间和峰面积值，按公式（ 1）计算含量： GA/T 6 添样添 样添样 VMA VMAW = . (1) 式中： W 检材样品 中目标物质含量，单位为 纳 克每 毫 克 (ng/mg）或 纳 克每毫升（ ng/mL)； A 样 检材 样品 衍生液 中目标物质平均峰面积； A 添 添加样品 衍生液 中 目标物 平均峰面积 平均值 ； M 添 添加样品中 目标物 添加量，单位为 纳 克 (ng)； M 样

22、 检材样品的取样量 ，单位为 毫 克（ mg）或毫升（ mL）； V 添 添加样品的定容体积，单位为毫升 (mL)； V 样 检材 样品的定容体积，单位为毫升 (mL)。 7.2.3.1.2 内标 -单点 法 记录各样品 衍生液 平行进样 2 3 次的 目标物保留时间和峰面积值， 按公式 （ 2） 计算校正因子，按 公式 （ 3） 计算含量 ： MAf = 标内 内标 . (2) 式中： f 校正因子； M标 添加样品中 目标物添加量 ，单位为纳克 (ng)； A内 添加样品 衍生液 中 内标物峰面积 平均值 ； M内 添加样品中 内标物添加量 ，单位为纳克 (ng)； A 标 添加样品 衍生

23、液 中 目标物峰面积 平均值 。 样样添 添添样 VMA VMAfW = . (3) 式中： W 检材样品中目标物 含量 ，单位为纳克每毫 克 （ ng/mg） 或纳克每毫升（ ng/mL） ； f 校正因子； A 样 检材样品衍生液 中目标物峰面积 平均值 ； A 添 添加样品 衍生液中 目标物峰面积 平均值 ； M 添 添加样品中 目标物 添加量 ，单位为纳克 （ ng） ； M 样 检材样品 的 取样量 ，单位为毫克 （ mg）或毫升（ mL） ； V 添 添加样品的定容体积 ，单位为毫升 （ mL） ； V 样 检材 样品的定容体积 ，单位为毫升 （ mL） 。 7.2.3.2 计算相

24、对相差 记录 2 份平行操作的 检材样品中目标物的 含量，按公式（ 4）计算相对相差： %10021 = X XXRD . (4) 式中： RD 相对相差 ，用百分比（ %）表示 ； X1、 X2两个检材样品平行定量测定的含量数值； GA/T 7 X 两个检材样品平行定量测定含量的平均值。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳 性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物 衍生物 的色谱峰保留时间与标准溶液 中目标物 一 致（相对误差在 1%之内），且在扣除背景后的检材样品质谱图中，目标物的质谱特征离子（不少于 3 个）与标准溶液中目标物 一致，特征离子丰度比与浓度接

25、近的标准溶液相比，相对偏差不超过表 1 规定 的范围，空白样 品无干扰，则可判断检材样品中检出 相应 目标物。 表 1 特征离子丰度比的最大允许相对偏差范围 特征离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 10 15 20% 50% 8.1.2 阴 性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱 峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 方法检出限参见附录 A。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按 两 份检材的平均值计算。 如果检材样品中 目标物含量的 RD 20

26、%，定量数据不可靠。应按 7.2重新提取检验。 相关实验数据及谱图 参 见附录 A。 GA/T 8 附 录 A （资料性附录） 相关实验数据 及 图 谱 A.1 GC-MS 仪器 分析 未衍生化待测物与内标物的保留时间与选择监测离子 见表 A.1。 表 A.1 未衍生化待测物与内标物的保留时间与选择监测离子 成分 吗啡 O6-单乙酰吗啡 O3-单乙酰吗啡 乙基吗啡 tR min 9.665 10.165 10.066 9.47 SIM m/z 285,162,215 268, 327 285, 323 162, 313 A.2 GC-MS 仪器分析 MBTFA 或 MSTFA 衍生化后待测物与

27、内标物的保留时间与选择监测离子 见表 A.2。 表 A.2 MBTFA 或 MSTFA 衍生化后待测物与内标物的保留时间与选择监测离子 成分 吗啡 -2TFA O6-单乙酰吗啡 -TFA O3-单乙酰吗啡 -TFA 乙基吗啡 -TFA tR min 8.6 9.5 9.9 9.4 SIM m/z 364, 477 364, 423 381, 268 296, 409 A.3 标准物质 及其 MBTFA 衍生化产物 GC-MS/SIM 谱图见图 A.1 和图 A.2。 GA/T 9 说明 ： 1-乙基吗啡 ，保留时间为 9.47min； 2-吗啡 ，保留时间为 9.66min； 3-O3-单乙酰

28、吗啡 ，保留时间为 10.066min； 4-O6-单乙酰吗啡 ，保留时间为 10.166min。 图 A.1 标准物质 GC-MS/SIM 谱图（标准浓度均为 10ng/L） 1 2 3 4 GA/T 10 说明 ： 1-吗啡 -2TFA； 3-乙基吗啡 -TFA； 4-O6-单乙酰吗啡 -TFA； 5-O3-单乙酰吗啡 -TFA。 图 A.2 MBTFA 衍生化后 GC-MS 总离子流色谱图 A.4 线性范围及添加回收 率 见表 A.3。 吗啡、单 乙 酰吗啡在血液中的测量线性范围均在 10ng/mL 1000ng/mL。 表 A.3 空白添加相对回收率 待测物 添加浓度 ng/ml 相对回收率 吗啡 2TFA 10 93.3% 100 115.7% 1000 107.7% O6-单乙酰吗啡 -TFA 10 101.2% 100 92% 1000 79.3% A.5 GC-MS 分析，经提取衍生化后， 毛发 中 吗啡、单乙酰吗啡 检出限为 2ng/mg，血液 中 吗啡、单乙 酰吗啡 检出限为 5ng/mL。