DB63 T 1163-2012 牦牛体外受精胚胎生产技术操作规程.pdf

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1、ICS 65.020.30 B 43 备案号：35830-2013 DB63 青海省地方标准 DB 63/T 11632012 牦牛体外受精胚胎生产技术操作规程 2012 - 12 - 04 发布 2013 - 01 - 01 实施 青海省质量技术监督局 发布 DB63/T 11632012 I 前 言 本规程依据GB/T 1.12009的规则编写。 本规程由青海省畜牧兽医科学院提出并归口。 本规程起草单位：青海省畜牧兽医科学院畜牧研究所。 本规程主要起草人：徐惊涛、孙永刚、才让东智、马志杰。 DB63/T 11632012 1 牦牛体外受精胚胎生产技术操作规程 1 范围 本规程规定了牦牛体外

2、受精胚胎生产的术语和定义、牦牛卵母细胞分级、体外成熟、体外受精及受 精卵体外培养的方法和牦牛胚胎分级。 本规程适用于牦牛体外受精胚胎生产技术推广应用的规范化操作。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4143 牛冷冻精液 GB/T 25881 牛胚胎 NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本规程。 3.1 卵母细胞体外成熟 In vitro matu ration，IVM 指从活体或离体牦牛卵巢的卵泡

3、中采集未成熟的卵母细胞，在体外进行培养，使之恢复减数分裂到 MII期并具备受精能力的发育过程。 3.2 体外受精 In vitro fertilization，IVF 通过人为操作使哺乳动物的精子和卵子在体外环境中完成受精过程的技术。 3.3 体外胚胎生产技术 In vitro em bryo production，IVEP 通过采集牦牛卵母细胞，将之经过体外成熟培养 (In vitro m aturation，IVM)后与获能的精子进 行体外受精 (In vitro fertilization， IVF)，再经过受精卵的体外培养(In vi tro culture，IVC)等 一系列过程，在

4、体外生产出可用于移植胚胎的技术。 4 试剂、耗材、设备和实验室要求 4.1 试剂 DB63/T 11632012 2 所用的试剂、药品以及要求见附录A。 4.2 耗材 所用耗材见附录A。 4.3 设备 所用主要设备见附录A。 4.4 实验室要求 工作区由准备室、缓冲间、无菌间、细胞保存室组成。其中，缓冲间面积不小于3平方米，并设有 更衣柜和紫外灯。紫外灯管距地面不应超过2.5米，每平方 厘米有0.06微瓦能量的照射，每次照射时间 为20分钟30分钟。无菌室无菌等级的最低标准应达到万级。各种器具的清洗、消毒见附录B。 5 卵母细胞采集 5.1 活体采卵 借助超声波探测仪直接从活体牦牛的卵巢中吸取

5、卵母细胞。其方法是：直肠把握卵巢，用超声波显 像仪和7.5/5.0 兆赫兹阴道扇形探头观察卵巢形态和卵泡位置，使卵泡位于采卵器的进针线上，然后开 启真空泵并推进19号采卵针（长60厘米）对卵泡进行穿刺，将含有卵母细胞的卵泡液抽入集卵杯。采卵 液的配置见附录C。 5.2 屠宰后的牦牛卵母细胞的采集 牦牛屠宰后30分钟内从体内摘取卵巢，置于2535含青霉素（100单位/毫升）和链霉素（100 微克/毫升）的生理盐水中，2小时内运回实验室，在无菌条件下洗涤卵巢、去除其周围结缔组织后，用 消毒后的纱布或木质纤维纸巾沾干上面的生理盐水并包裹后， 使用带18号针头的10毫升一次性注射器从 卵巢内部抽取表面

6、直径2毫米6毫米卵泡。 5.3 牦牛卵母细胞筛选 将收集到的卵泡液转入直径100毫米培养皿中，在实体显微镜下检出卵丘-卵母细胞复合体 （Cumulus-oocyte complexes, COCs），并按如下方法进行分类， A、B级用于体外受精: A 级：卵丘细胞层完整而致密、卵母细胞大小正常，细胞质均匀，颜色较暗并充满透明带； B 级：卵丘细胞不够完整或较松散，层数较少，卵母细胞颜色稍浅； C 级：卵丘细胞少或膨大变性，卵母细胞颜色浅或裸卵。 6 牦牛卵母细胞体外成熟 6.1 卵母细胞成熟培养 在直径60毫米无菌培养皿中用卵母细胞成熟培养液制作10个体积为50微升培养滴， 覆盖石蜡油后在 C

7、O2培养箱平衡2小时。将收集的A级和B级COCs在成熟培养液清洗3遍后，每15个COCs转入50微升成熟培 养微滴中，置入39、5%CO 2饱和湿度的培养箱中成熟培养24小时。卵母细胞成熟培养液的配制见附录C。 6.2 卵母细胞成熟的判定 DB63/T 11632012 3 显微镜下观察培养24小时的牦牛卵母细胞， 卵丘细胞膨大扩散， 卵母细胞质均匀、 没有空泡， 用0.1% 透明质酸酶除去卵丘细胞后能见到第一极体（Pb1）为已成熟，否则为未成熟卵母细胞。 7 牦牛卵母细胞体外受精 7.1 受精微滴制作 在直径35毫米的培养皿中制备50 微升IVF 微滴，覆盖石蜡油；提前2小时放入39、5%C

8、O 2 饱和湿 度的培养箱中平衡备用。受精液的配制见附录C。 7.2 冷冻精液的清洗分离 冷冻精液品质鉴定依据GB 4143。细管冷冻精液在37温水解冻40秒后，转入Percoll梯度分离液 (45%/90%) 中150 0转/分钟离心20分钟，弃掉上清液后加入BO工作液（BO wo rking solution）100 0转/ 分钟离心5分钟，弃去上清液后用血球计数板计算精子数，然后使用BO工作液调整精子浓度为10 10 6 个/ 毫升。BO工作液的配制见附录C。 7.3 体外受精 每个受精微滴中加入50微升浓度调整后的精液，将成熟培养24小时的牦牛卵母细胞，用BO工作液清 洗两遍后每15个

9、一组移入IVF微滴中，在39、5%CO 2饱和湿度的培养箱中受精培养18小时20小时。 8 受精卵培养 受精结束后，将受精卵移入含有200微升培养液的1.5毫升离心管中，在震荡器上震荡40秒去除颗粒 细胞，受精卵用胚胎培养液洗涤3次，每20个受精卵移入已平衡2小时以上、覆盖石蜡油的50微升受精卵 培养微滴中或输卵管上皮细胞共培养微滴中培养，每隔48小时半量更换培养液。受精后48小时统计卵裂 率并吸弃未分裂的卵母细胞，继续培养至第6天-7天，定期观察早期胚胎发育情况。 9 胚胎的鉴定和分级 9.1 牦牛胚胎的鉴定 9.1.1 在 20 倍40 倍体视显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、

10、均匀度、细胞的密度与 透明带的间隙以及变性情况等。胚胎的鉴定主要依据 GB/T 25881 、NY/T 1674。 9.1.2 凡卵子的卵黄未形成分裂球以及细胞团的、均列为未受精卵。 9.1.3 胚胎的发育阶段： a）桑葚胚（ morula） 可观察到球状的细胞团，细胞团占透明带内腔 50%60%。 b）致密桑葚胚（ compacted morula， CM） 卵裂球细胞进一步分裂变小，细胞团占透明带内腔 60%-70%。 c）早期囊胚（ early blastocyst， EB） 内细胞团的一部分出现囊胚腔，但难以分清内细胞团和滋 养层，细胞团占透明带内腔 70%80%。 d）囊胚（ bla

11、stocyst， BL） 内细胞团和滋养层界限清晰，囊胚腔明显，细胞充满透明带内腔。 e）扩张囊胚（ expanded blastocyst， EXB） 囊胚体积增大到原来的 1.2 倍 1.5 倍，透明带变薄。 f）孵化囊胚（ hatched blastocyst， HB） 囊胚腔继续扩大，透明带破裂，细胞团脱出。 DB63/T 11632012 4 9.2 牦牛胚胎分级 9.2.1 根据体外胚胎的形态结构和发育能力， 分为 A 级、 B 级和 C 级三个等级。 胚胎分级主要依据 GB/T 25881、NY/T 1674： A 级：胚胎结构形态完整，轮廓清晰，呈球形；分裂球大小均匀，结构紧凑

12、，色调和透明度适 中，无附着的细胞和液泡； B 级： 轮廓清晰， 色调及细胞密度良好， 可见到少量附着的细胞和液泡， 变性细胞约占 10%30%； C 级：轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较多，变性细胞达 30%50%。 9.2.2 胚胎的分级主要是便于移植。A 级、B 级和 C 级胚胎均为可用胚，但 A 级和 B 级胚胎可进行冷冻 保存，C 级胚胎只用于鲜胚移植。 DB63/T 11632012 5 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂、耗材和设备 A.1 主要试剂及要求 A.1.1 主要试剂 氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、磷酸氢二钠（Na 2HPO4）、磷酸二

13、氢钾（KH 2PO4）、氯化钙（CaCl 2）、 二水氯化钙 （CaCl 22H2O） 、 二水磷酸二氢钾 （NaH 2PO42H2O） 、 六水氯化镁 （MgCl 26H2O） 、 碳酸氢钠 （NaHCO 3） 、 酚红（Phenol Red）、葡萄糖、丙酮酸钠、青霉素、链霉素、促卵泡素（FSH）、雌二醇（E 2）、胎牛 血清（FBS）、犊牛血清（CS）、牛血清白蛋白（BSA ）、Theophylline、石蜡油。 A.1.2 试剂要求 所用的试剂为Sigma公司产品，均为细胞培养测试级或胚胎培养测试级，符合组织细胞培养要求。 A.2 主要耗材 A.2.1 培养皿：35毫米、60毫米、100

14、毫米 A.2.2 注射器：1毫升、10毫升、20毫升、50毫升 A.2.3 滤器：0.22微米、0.45微米 A.2.4 离心管：0.5毫升、1.5毫升、10毫升、50毫升 A.2.5 0.25毫升塑料胚胎麦管 A.2.6 封口膜 A.2.7 胚胎吸管 A.3 主要设备 A.3.1 CO2培养箱 A.3.2 体视显微镜 A.3.3 胚胎冷冻仪 A.3.4 液氮生物容器 A.3.5 超纯水仪 A.3.6 恒温台 A.3.7 生物安全柜或超净工作台 A.3.8 电子天平（精确到0.1毫克） A.3.9 高压灭菌器 A.3.10 离心机 A.3.11 超声波清洗仪 A.3.12 超声波显像仪 A.3

15、.13 7.5/5.0兆赫兹阴道扇形探头 DB63/T 11632012 6 B B 附 录 B （规范性附录） 试验准备 B.1 器具洗涤 B.1.1 玻璃器皿清洗 B.1.1.1 浸泡 新购置的玻璃器皿使用前应先用自来水简单刷洗，然后用5%稀盐酸溶液浸泡12小时以上；其它培养 后的玻璃器皿在含有洗涤剂的清水中浸泡，不应留有气泡。 B.1.1.2 刷洗 浸泡后的玻璃器皿用软毛刷洗刷， 洗刷时用力要轻， 防刮底， 防死角， 反复洗刷后用清水冲洗， 60 下烘干。 B.1.1.3 酸浸 洗刷的玻璃器皿冲洗干燥后，置酸液中浸泡24小时，以除去清洗后残留的极微量杂志。酸浸时间为 24小时。酸液的配方

16、见表B.1。 表B.1 三种强度酸液的配方 组 成 强 度 重铬酸钾（克） 浓硫酸（毫升） 去离子水（毫升） 强液 63 1000 200 次强液 120 200 1000 弱液 100 100 1000 B.1.1.4 冲洗 酸浸后先用自来水反复冲洗10次以上，最后用超纯水浸洗3次5次，烘干包装。 B.1.2 金属器皿清洗 金属材质的器具除了没有酸浸处理步骤外，其余步骤同B.1.1。 B.1.3 塑料与橡胶制品清洗 塑料盒橡胶材质的器具用清水浸泡和冲洗同玻璃器皿清洗，之后还需要用2%的NaOH溶液浸泡12 小 时，清水冲洗和烘干后用1%稀盐酸浸泡30分钟，再用清水和三蒸水分别冲洗3次，高压灭

17、菌和烘干后备 用。培养使用的塑料器皿是一种无毒并已经消毒过的灭菌密封包装的一次性使用物品，用时只要打开包 装即可。 B.2 器具消毒 DB63/T 11632012 7 B.2.1 高压湿热消毒灭菌 适用于玻璃器具、 金属制品、 耐压耐热的塑料制品以及可用高压灭菌的无机盐溶液和液体石蜡油等。 根据物品种类选择不同的压力和时间：一般物品（如布类、金属器械、玻璃器皿等）消毒的要求是0.15 MPa 20分钟；橡胶制品为0.1 MPa 1 2115分钟；常规液体为0.15 MPa15分钟。 B.2.2 滤过消毒 采卵液、体外成熟液、受精液、胚胎培养液等用0.22微米滤膜过滤除菌，胎牛血清和犊牛血清等

18、用 0.45微米滤膜过滤除菌，过滤时应弃去开始的2滴3滴。 B.2.3 紫外线消毒 B.2.3.1 对空气、操作台表面和一些不能使用其他方法进行消毒的培养器皿（如塑料培养皿、培养板 等）采用紫外线消毒。 B.2.3.2 培养室的紫外线灯应距地面2.5米，塑料制品可放在无菌间距紫外灯50厘米80厘米处，使每 平方厘米有0.06微瓦能量的照射，容器内侧向上，塑料吸管需垂直置于紫外灯下照射30分钟以上。 B.2.4 干热消毒灭菌 耐高温的玻璃及金属器具，包装好后放入烘干消毒箱内160处理1 小时1.5小时，或者在温度升 至180以后，关闭开关，待恢复常温取出。 DB63/T 11632012 8 C

19、 C 附 录 C （规范性附录） 试剂配制 C.1 采卵液的配制 C.1.1 改进PBS液的配方（m-PBS） 改进PBS液的配方见表C.1。 表C.1 m-PBS 配方 NaCl 8.0 克/升 KCl 0.2 克/升 Na2HPO4 1.15 克/升 KH2PO4 0.2 克/升 CaCl2 0.1 克/升 MgCl26H 2O 0.1 克/升 葡萄糖 1.0 克/升 丙酮酸钠 0.036 克/升 青霉素 100 单位/毫升 链霉素 100 微克/毫升 超纯水加至 1000 毫升 C.1.2 m-PBS液的配制 A液配制：将NaCl、KCl、Na 2HPO4、KH 2PO4用超纯水配制约7

20、00毫升溶液； B液配制：将CaCl 2和MgCl 26H2O用超纯水配制成约100毫升溶液； 然后将B液分多次缓慢加入到A液中，及时摇动，使A液和B液充分混合后，将葡萄糖、丙酮酸钠、青 霉素和链霉素再加入到混合液中溶解，并用超纯水定容至1000毫升。调节PH为7.27.4，渗透压为255 毫渗270毫渗，0.22微米滤器过滤除菌，4保存一个月。 C.1.3 采卵液的配制 采卵液为含3%CS的m-PBS液，即将配好的m-PBS液取 97毫升，再加入3毫升犊牛血清(CS)，0.22微米 滤器过滤除菌，4保存一周。 C.2 体外成熟培养液 C.2.1 各种保存液的配制 丙酮酸钠保存液：110毫克丙

21、酮酸钠溶于10毫升生理盐水中，4保存一周。 FSH保存液：以20单位/毫升浓度将FSH溶于生理盐水中，然后每10微升分装到0.5毫升离心管中， -20长期保存。 DB63/T 11632012 9 E2保存液：将E 2溶解于无水乙醇中，浓度为1毫克/毫升，分装到避光瓶中，-20长期保存。 抗生素保存液：青霉素20万单位，链霉素0.2克， 溶解于2毫升生理盐水中，每10微升分装到0.5毫 升离心管中，-20长期保存。 TCM-199：TCM-199含25毫摩尔Hepes和0.26毫摩尔NaHCO 3 C.2.2 成熟培养液 成熟培养液配方见表C.2。 表C.2 成熟培养液配方 TCM-199 9

22、 毫升 最终浓度 FBS 1 毫升 10% FSH 10 微升 0.2 单位/毫升 E2 10 微升 1 微克/毫升 丙酮酸钠 20 微升 0.2 毫摩尔 抗生素 10 微升 青霉素 100 单位/毫升，链霉素 100 微克/毫升 其中，以上各种试剂除E 2液，混合后0.22微米滤器过滤除菌，然后加入E 2保存液10微升，4保存一 周。 C.3 体外受精液的配制 C.3.1 BO Stock A和Stock B液的配制 BO Stock A和Stock B液的配方分别见表C.3和表C.4。BO Stock A液配好后高压灭菌，4保存一个 月。B液配好后通入CO 2气体20分钟，使B液的颜色由粉

23、红色变浅，高压灭菌4保存一个月。 表C.3 BO Stock A 液配方 Stock A 液： 500 毫升 NaCl 4.3092 克 KCl 0.1974 克 CaCl22H 2O 0.2171 克 NaH2PO42H 2O 0.0840 克 MgCl26H 2O 0.0697 克 0.5%酚红 0.1 毫升 表C.4 BO Stock B 液配方 Stock B 液： 200 毫升 NaHCO3 2.5873 克 0.5%酚红 0.04 毫升 C.3.2 BO工作液配制 BO工作液配方见表C.5。BO工作液配好后0.22微米滤器过滤除菌，4保存一周。 DB63/T 11632012 10 表C.5 BO 工作液配方 BO 工作液 100 毫升 最终浓度 Stock A 76 毫升 Stock B 24 毫升 丙酮酸钠 0.01375 克 1.25 毫摩尔 葡萄糖 0.25 克 13.9 毫摩尔 抗生素 100 微升 青霉素 100 单位/毫升，链霉素 100 微克/毫升 C.3.3 受精液的配制 受精液的配方见表C.6。受精液配好后0.22微米滤器过滤除菌，4保存一个月。 表C.6 受精液配方 BO 工作液 10 毫升 最终浓度 BSA 60 毫克 3 毫克/毫升 Theophylline 0.009 克 2.5 毫摩尔 _