DB63 T 1159-2012 甘蓝型杂交油菜品种纯度检验 ISSR操作规程.pdf

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1、ICS 65.020.20 B 33 备案号：35826-2013 DB63 青海省地方标准 DB 63/T 11592012 甘蓝型杂交油菜品种纯度检验 ISSR 操作规程 2012 - 12 - 04 发布 2013 - 01 - 01 实施 青海省质量技术监督局 发布 DB63/T 11592012 I 前 言 本规程按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本规程由中国科学院西北高原生物研究所提出并归口。 本规程起草单位:中国科学院西北高原生物研究所、青海省种子管理站。 本规程主要起草人：李毅、胡延萍、宋晓荭、彭秉玉、王莉、王焕强、巩爱岐、包天忠、王溪、冯 承彬。 DB63/T

2、11592012 1 甘蓝型杂交油菜品种纯度检验 ISSR 操作规程 1 范围 本规程规定了甘蓝型杂交油菜（ Brassica napus L.和 Brassica campestris L.）品种纯度ISSR 指纹鉴定的术语和定义、设备与耗材、试剂及溶液的配制、操作程序、判定原则及报告等技术内容。 本规程适用于各级科研、推广、生产单位和种子部门等在甘蓝型杂交油菜品种纯度检验时使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.1 农作物

3、种子检验规程 总则 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本规程。 3.1 聚合酶链式反应 （以下简称 PCR） 一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。 3.2 引物 一条互补结合在模板DNA链上的短的单链，在3 -OH端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补 链。 3.3 简单重复序列区间 （以下简称 I

4、SSR） 根据某个简单重复序列（微卫星位点）作为特异引物，通过PCR反应扩增模板 DNA链上微卫星位点 间隔的碱基序列。 4 设备与耗材 DB63/T 11592012 2 4.1 设备 高速低温离心机； PCR 扩增仪； 多用电泳仪及水平式电泳槽； 紫外凝胶成像系统； 微量移液器： 规格为 0.2 L-2L， 1L-10L， 2L-20L， 5L-50L， 20L-200L， 200L-1000L； 电子分析天平； 磁力加热搅拌器； 蒸汽压力灭菌锅； 恒温水浴锅； 微波炉。 4.2 耗材 离心管：0.2mL，1.5mL，2.0mL； 研钵； 移液器吸头：20 L，200 L 和1000 L；

5、 烧杯； 三角烧瓶； PE 手套：一次性聚乙烯手套。 5 试剂及溶液的配制 5.1 试剂要求 试剂需使用分析纯级。配制试剂所使用的水，除另有说明外，使用按 GB/T 6682规定的一级水。 5.2 试剂 CTAB: 十六烷基三甲基溴化胺； -巯基乙醇； Tris：三羟甲基氨基甲烷； PVP：聚乙烯吡咯烷酮碘络合物； Taq E：DNA聚合酶，附带 6 倍loa ding buffer、1 0 倍 buffer 和 25. 0mmol/L MgCl2； dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸； DNA/Hind marker 100bp 或200bp DNA marker； EB：溴化乙锭 10倍 buf

6、fer：10 倍反应缓冲液； 氯化镁； 6 倍loading buffer：6倍上样缓冲液； Primer：引物； EDTANa 2 2H20：乙二胺四乙酸二钠； ddH 2O：经高压灭菌的二次蒸馏水； 氯化钠； DB63/T 11592012 3 氢氧化钠； 无水乙醇； 氯仿； 异戊醇； 异丙醇； 盐酸； 醋酸； 石英砂； 琼脂糖。 5.3 溶液的配制 见附录 A。 6 操作程序 6.1 植物样品准备 6.1.1 受检样品种子的扦样、分样和保存，按 GB/T 3543.2 的规定执行。 6.1.2 测试样品的数量及淘汰值按 GB/T 3543.5 中的规定执行，见附录 E。 6.1.3 种子

7、按 GB/T 3543.4 规定的方法发芽，取苗龄一周的叶片提取基因组 DNA。 6.2 DNA 样品提取 a) 将 2 倍CTAB提取缓冲液在 65水浴中预热。 b) 取新鲜叶片约 20mm2 放入研钵中，加少许石英砂和 PVP 干粉迅速研磨。 c) 将所得研磨物转入 2.0mL 离心管中，加入 900 L 预热的 2 倍 CTAB 提取缓冲液， 65水浴保 温 30min，每隔 10min 将离心管上下轻轻摇匀。 d) 加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管 10min 使其充分混匀，置于高速低温离心机中， 10000r/min离心 10min，取上清液转移至另一个 1.5mL 离心管。

8、 e) 重复第 d)步。 f) 在上清液中加入 2/3 体积预冷至-20的异丙醇，将离心管轻轻摇匀，置于-20的冰箱中放置 30min，或者过夜。 g) 高速低温离心机 10000r/min，4离心 6min， 弃上清液。 h) 加入75%的乙醇500 L，高速低温离心机 10000r/min 离心5min，弃上清液。 i) 重复第 h)步， 置于 37或者室温下自然风干。 j) 按本规程 6.3 和6.4 提供的方法，加入 ddH2O 溶解 DNA，使溶液的 DNA 浓度至 40.0ng/ L。DNA 样品置于 4下待用，或-20下储存。 6.3 DNA 样品质量检测 同时使用下述两种方法对

9、DNA样品进行质量检测 ，若检测结果不符合两者中的任一要求，应重新提 取DNA。 a) 取40 L DNA样品稀释 50倍，用紫外分光光度计测定其 A260值和 A280 值。A260/A280的比值 应在 1.6 - 2.0 之间。 DB63/T 11592012 4 b) 按照附录 A.8 制备0.80%琼脂糖凝胶，放入电泳槽中，点样孔处于电泳负极端，小心拔下梳子， 加入 1 倍TAE 缓冲液并没过胶面约 1.0mm。取4 L DNA 样品和 1 L 6倍loading buffer 混匀， 加到点样孔中，在另一点样孔中加入 DNA/Hind marker，电压3 V/cm - 5V/cm

10、，进行电泳 检测。紫外凝胶成像系统下观察，DNA 样品应在23kb 处有一条清晰的条带。 6.4 DNA 浓度计算 DNA样品浓度按公式（1）计算，单位：ng/ L。 DNA样品浓度=A 26050 ng/L稀释倍数 .(1) 6.5 PCR 扩增 6.5.1 反应体系 反应液体积为 20.00L，组分配制应符合表1的规定。 表1 PCR 扩增反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 反应体积 ddH2O 13.80L 10倍Buffer 10倍 1.250倍 2.50 L MgCl2 25.0mmol/L 1.500 mmol/L 1.20L dNTP 2.5mmol/L 0.125 mmol/L

11、 1.00L 引物 10.0 mol/L 0.200mol/L 0.40L Taq E 5.0U/L 0.025U/L 0.10L DNA样品 40.0ng/ L 2.000ng/L 1.00L 合计 20.00 L 6.5.2 反应程序 PCR扩增程序如图1所示，其中X为选用引物的退火温度，见附录B.2： 图1 PCR 扩增反应程序图 94预变性 5min 94变性 20s X退火 1min 72延伸 80s 72延伸 6min 4冷却保存 38 个循环 DB63/T 11592012 5 6.5.3 PCR 扩增产物的检测 按照附录A.8制备1.50%琼脂糖凝胶，放入电泳槽中，点样孔处于电

12、泳负极端，取下梳子，加入1倍 TAE缓冲液并没过胶面约1.0mm。取10 L PCR扩增产物和1 L 6倍loading buffer混匀，加到点样孔中， 在另一点样孔中加入4 L 的100bp或200bp DNA marker，电压3 V/cm - 5V/cm，进行电泳检测。电泳 结束后，琼脂糖凝胶放入紫外凝胶成像系统，拍照记录。 6.5.4 数据记录 对凝胶成像结果进行人工读带，同一引物的扩增产物其电泳迁移率一致的条带为同一位点。各位点 按条带阳性为1、条带阴性为0，记录电泳带谱，排除其中模糊不清的带和无法准确标记的带。对每个样 品的扩增条带进行记录。 6.5.5 引物选择 从加拿大Bri

13、tish Columbia大学设计的100个ISSR引物中，序列见附录B.1，筛选扩增条带清晰、重 复性好的引物。推荐使用的13条引物及其序列见附录B.2。优先使用推荐类型 的3条引物，若未获得确 定结果，再依次增加推荐类型 的其他引物。 7 判定原则 7.1 标准数据库的建立 7.1.1 按本规程 6.5.5 选定引物； 7.1.2 对标准品种的种子按照本规程的规定进行扩增和记录。标准品种的种子其真实性应准确无误； 7.1.3 标准品种应至少涵盖：目标品种及其父本和母本、亲缘关系较近的杂交品种及其父本和母本、 甘蓝型油菜常规品种和白菜型油菜常规品种。各品种应记录 13 个-20个种子的测定数

14、据。 7.1.4 测定数据按 NTSYSpc 软件的要求，建立数据矩阵。用 NTSYSpc 软件中按SM 遗传相似系数进行 UPGMA 聚类； 7.1.5 如各品种可以独自聚为一组，该矩阵即为标准数据库； 7.1.6 如部分品种不能单独聚为一组，应按本规程 6.5.5 的规定增加引物进行测定和计算，直至符合 本规程 7.1.5 的要求。 7.1.7 附录 C 为推荐类型 I 的3 条引物对青杂 2 号、3 号、5 号及其各自父本和母本，青油 14号和浩 油 11 号油菜品种进行扩增建立的标准数据库。 7.2 标准数据库的补充与修改 选取新品种及其父本和母本的标准种子，标准种子的真实性应准确无误

15、。按照本规程的规定对标准 种子进行扩增，将扩增结果增加到标准数据库中。当标准数据库过大时，可按7.1.3的要求进行删减。 7.3 品种判定 将 100个待检品种个体的检测数据添加到标准数据库中，用 NTSYSpc软件按SM遗传相似系数进行 UPGMA聚类。检测个体与目标品种的标准数据聚为同组的为相同品种，其余为异品种 。 7.4 品种纯度检测 品种纯度按公式（ 2）计算，以 %表示： DB63/T 11592012 6 P= T DT N NN 100 .(2) 式中： P-品种纯度 NT-供检种子粒数（幼苗数）； ND-判定为异品种的种子粒数（幼苗数）。 7.5 种子质量符合性判定 按GB/

16、T 3543.5的规定执行，容许差距见附录E。 8 报告 按GB/T 3543.1的规定执行。 9 注意事项 9.1 在本规程的操作过程中，凡在接触到溴化乙锭（EB）时，必须带双层一次性聚乙烯手套，在完成 该操作后立即脱去。 9.2 加有溴化乙锭（EB）的凝胶及接触到溴化乙锭（EB）的所有物品，须按 GB/T19495.2 的规定进行 处置。 DB63/T 11592012 7 附 录 A （规范性附录） 溶液的配制 A.1 2 倍CTAB提取缓冲液 称取CTAB 10.00g和NaCl 40.90g放入烧杯，加入100 .00mmol/L Tris-HCl 50.0mL和0. 50mol/L

17、 EDTA 20.0mL, 慢慢加热使CTAB完全溶解， 然后定容至500.0mL， 高压灭菌备用， 用前加入0.2%的-巯基乙醇。 A.2 1.00mol/L Tris-HCl 称取Tris 12.11g，加ddH 2O 80.0mL,溶解后边搅拌边加浓盐酸调pH至 8.0(约需浓盐酸4.2mL)定容至 100.0mL，高压灭菌。 A.3 0.50mol/L EDTA 称取EDTANa 2 2H20 18.61g溶于80.0mL ddH 2O中，磁力搅拌机搅拌，用固体NaOH调p H至8.0(约需固体 NaOH 2g)，定容至100.0mL，高压灭菌。 A.4 氯仿：异戊醇 将氯仿与异戊醇按

18、体积比24: 1混合，贮于棕色瓶中。 A.5 10.00mg/L EB 取EB 1.00g溶于100 .0mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解，分装至用铝箔包裹的1.5mL离心管中。 A.6 50 倍TAE缓冲液 称取Tris 242.00g溶于500.0mL ddH 2O中，加醋酸 57.1mL和0.5mol/L EDTA 100.0mL，待其完全溶 解后加ddH 2O定容至1000.0mL。 A.7 1 倍TAE缓冲液 取50倍TAE 20.0mL，加入ddH 2O至1000.0mL，充分混匀。 A.8 琼脂糖凝胶（0.80%或 1.50%）的配制 称取琼脂糖0.80g（或1.50g）置于200.

19、0 mL三角瓶中，用1倍TAE 100.0mL溶解，在微波炉中融化至 溶液透明，然后冷却至50 - 60后，加入EB使其终浓度到0.50 g/mL，混匀后将凝胶倒入制胶模中， 然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度在3.0mm - 5.0mm之间，待凝胶完全凝固后放入电泳槽中备用。 DB63/T 11592012 8 A A 附 录 B （资料性附录） 表 B.1 哥伦比亚大学 Set #9 引物序列 编号 序列 编号 序列 UBC801 ATA TAT ATA TAT ATA TT UBC851 GTG TGT GTG TGT GTG TYG UBC802 ATA TAT ATA TAT ATA

20、 TG UBC852 TCT CTC TCT CTC TCT CRA UBC803 ATA TAT ATA TAT ATA TC UBC853 TCT CTC TCT CTC TCT CRT UBC804 TAT ATA TAT ATA TAT AA UBC854 TCT CTC TCT CTC TCT CRG UBC805 TAT ATA TAT ATA TAT AC UBC855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT UBC806 TAT ATA TAT ATA TAT AG UBC856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA UBC807 AGA GAG AGA GA

21、G AGA GT UBC857 ACA CAC ACA CAC ACA CYG UBC808 AGA GAG AGA GAG AGA GC UBC858 TGT GTG TGT GTG TGT GRT UBC809 AGA GAG AGA GAG AGA GG UBC859 TGT GTG TGT GTG TGT GRC UBC810 GAG AGA GAG AGA GAG AT UBC860 TGT GTG TGT GTG TGT GRA UBC811 GAG AGA GAG AGA GAG AC UBC861 ACC ACC ACC ACC ACC ACC UBC812 GAG AGA G

22、AG AGA GAG AA UBC862 AGC AGC AGC AGC AGC AGC UBC813 CTC TCT CTC TCT CTC TT UBC863 AGT AGT AGT AGT AGT AGT UBC814 CTC TCT CTC TCT CTC TA UBC864 ATG ATG ATG ATG ATG ATG UBC815 CTC TCT CTC TCT CTC TG UBC865 CCG CCG CCG CCG CCG CCG UBC816 CAC ACA CAC ACA CAC AT UBC866 CTC CTC CTC CTC CTC CTC UBC817 CAC

23、ACA CAC ACA CAC AA UBC867 GGC GGC GGC GGC GGC GGC UBC818 CAC ACA CAC ACA CAC AG UBC868 GGA GGA GGA GGA GGA GGA UBC819 GTG TGT GTG TGT GTG TA UBC869 GTT GTT GTT GTT GTT GTT UBC820 GTG TGT GTG TGT GTG TC UBC870 TGC TGC TGC TGC TGC TGC UBC821 GTG TGT GTG TGT GTG TT UBC871 TAT TAT TAT TAT TAT TAT UBC822

24、 TCT CTC TCT CTC TCT CA UBC872 GAT AGA TAG ATA GAT A UBC823 TCT CTC TCT CTC TCT CC UBC873 GAC AGA CAG ACA GAC A UBC824 TCT CTC TCT CTC TCT CG UBC874 CCC TCC CTC CCT CCC T UBC825 ACA CAC ACA CAC ACA CT UBC875 CTA GCT AGC TAG CTA G UBC826 ACA CAC ACA CAC ACA CC UBC876 GAT AGA TAG ACA GAC A UBC827 ACA

25、CAC ACA CAC ACA CG UBC877 TGC ATG CAT GCA TGC A UBC828 TGT GTG TGT GTG TGT GA UBC878 GGA TGG ATG GAT GGA T UBC829 TGT GTG TGT GTG TGT GC UBC879 CTT CAC TTC ACT TCA UBC830 TGT GTG TGT GTG TGT GG UBC880 GGA GAG GAG AGG AGA UBC831 ATA TAT ATA TAT ATA TYA UBC881 GGG TGG GGT GGG GTG UBC832 ATA TAT ATA TA

26、T ATA TYC UBC882 VBV ATA TAT ATA TAT AT UBC833 ATA TAT ATA TAT ATA TYG UBC883 BVB TAT ATA TAT ATA TA UBC834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT UBC884 HBH AGA GAG AGA GAG AG UBC835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC UBC885 BHB GAG AGA GAG AGA GA UBC836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA UBC886 VDV CTC TCT CTC TCT CT UBC837 TAT ATA T

27、AT ATA TAT ART UBC887 DVD TCT CTC TCT CTC TC DB63/T 11592012 9 表 B.1 哥伦比亚大学 Set #9 引物序列 （续） 编号 序列 编号 序列 UBC838 TAT ATA TAT ATA TAT ARC UBC888 BDB CAC ACA CAC ACA CA UBC839 TAT ATA TAT ATA TAT ARG UBC889 DBD ACA CAC ACA CAC AC UBC840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT UBC890 VHV GTG TGT GTG TGT GT UBC841 GAG AG

28、A GAG AGA GAG AYC UBC891 HVH TGT GTG TGT GTG TG UBC842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG UBC892 TAG ATC TGA TAT CTG AAT TCC C UBC843 CTC TCT CTC TCT CTC TRA UBC893 NNN NNN NNN NNN NNN UBC844 CTC TCT CTC TCT CTC TRC UBC894 TGG TAG CTC TTG ATC ANN NNN UBC845 CTC TCT CTC TCT CTC TRG UBC895 AGA GTT GTT AGC TCT TG

29、A TC UBC846 CAC ACA CAC ACA CAC ART UBC896 AGG TCG CGG CCG CNN NNN NAT G UBC847 CAC ACA CAC ACA CAC ARC UBC897 CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G UBC848 CAC ACA CAC ACA CAC ARG UBC898 GAT CAA GCT TNN NNN NAT GTG G UBC849 GTG TGT GTG TGT GTG TYA UBC899 CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCC A UBC850 GTG TGT GTG TGT

30、GTG TYC UBC900 ACT TCC CCA CAG GTT AAC ACA 表 B.2 推荐的 13 个 ISSR 引物 引物名称 推荐类型 * 引物序列5-3 退火温度（） UBC825 ACACACACACACACACT 54.2 UBC834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT 56.0 UBC835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 53.5 UBC809 AGAGAGAGAGAGAGAGG 57.5 UBC816 CACACACACACACACAT 55.2 UBC817 CACACACACACACACAA 56.5 UBC826 ACACACACACACACACC

31、57.0 UBC840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 58.9 UBC861 ACCACCACCACCACCACC 62.4 UBC866 CTCCTCCTCCTCCTCCTC 58.5 UBC880 GGAGAGGAGAGGAGA 57.2 UBC888 BDBCACACACACACACA 55.0 UBC891 HVHTGTGTGTGTGTGTG 56.5 注1： Y=(C,T)；B = (C, G, T)； D = (A, G, T)； H =(A, G, T)；V = (A, C, G )。 注2： * 型标记含推荐为首先采用的3个引物， 型标记含推荐为候补使用的10个引物。

32、DB63/T 11592012 10 附 录 C （资料性附录） 表 C 三引物在杂交油菜亲本及子代中的扩增结果 UBC835 UBC834 UBC825 品种 200 300 350 400 450 500 550 600 700 800 850 900 1000 1200 1300 1400 1500 1800 150 250 300 350 400 450 470 500 550 650 700 750 800 900 1000 1200 1300 1400 1800 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 900 1000 1100 12

33、00 1400 Z5F01 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 1 1111101110011 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0100 1 0 0 0 Z5F04 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 1111101110011 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0100 1 0 0 0 Z5F07 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1111101110011 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0100 1 0 0 0 Z

34、5F08 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1111101110011 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0100 1 0 0 0 Z5F09 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1111101110011 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0100 1 0 0 0 Z5F10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1111101110111 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0100 1 0 0 0 Z5F1 1 1 1

35、 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1111101110111 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0100 1 0 0 0 Z5F12 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1111101110011 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0100 1 0 0 0 Z5F13 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1111101110000 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0100 1 0 0 0 Z5F15 1 1 1 1 1 1 0

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37、1 1 1 1 0 0 1 1011101110011 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0100 1 0 0 0 Z5F23 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1011101110011 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0100 1 0 0 0 Z5PF03 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1001101010001 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0100 1 0 0 1 Z5PF04 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1

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