DB61 T 1001.2-2015 保健用品微生物限度检查 第2部分：菌落总数测定.pdf

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1、ICS 11.020 C 50 DB61 陕西省地方标准 DB 61/ T 1001.22015 保健用品微生物限度检查 第 2 部分： 菌落总数测定 Microbial limit examination for healthcare supplies Part 2: Tests for bacterial colony count 2015-12-29 发布 2016-03-01 实施 陕西省质量技术监督局 发布 DB61/T 1001.22015 I 目 次 前言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引 用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 设备和材料 . . 1

2、 5 培养基和试剂 . . 1 6 操作步骤 . . 2 7 结果和报告 . . 3 DB61/T 1001.22015 II 前 言 DB61/T 1001保健用品微生物限度检查分为以下5个部分： 第1部分：总则； 第2部分：菌落总数测定； 第3部分：铜绿假单胞菌检验； 第4部分：金黄色葡萄球菌检验； 第5部分：霉菌和酵母菌数测定。 本部分为DB61/T 1001的第2部分。 DB61/T 998保健用品安全性评价指导原则及试验方法与D B61/T 999保健用品功能学评价指导 原则及试验要求、DB61/T 1000保健用品产品标准编写规范、DB61/T 1001保健用品微生物限度 检查共同

3、构成了陕西省保健用品系列地方标准。 下面列出了这些地方标准的结构： a) DB61/T 998保健用品安全性评价指导原则及试验方法分为以下 6 个部分： 1) 第 1 部分：安全性评价指导原则； 2) 第 2 部分：皮肤急性毒性试验； 3) 第 3 部分：皮肤长期毒性试验； 4) 第 4 部分：皮肤刺激性试验； 5) 第 5 部分：皮肤过敏性试验； 6) 第 6 部分：眼部刺激性试验。 b) DB61/T 999保健用品功能学评价指导原则及试验要求分为以下 16 个部分： 1) 第 1 部分：总则； 2) 第 2 部分：改善微循环类功能学评价动物试验； 3) 第 3 部分：改善微循环类功能学评

4、价人体试验； 4) 第 4 部分：乳房保健类功能学评价动物试验； 5) 第 5 部分：乳房保健类功能学评价人体试验； 6) 第 6 部分：胃肠功能保健-助消化类功能学评价动物试验； 7) 第 7 部分：胃肠功能保健-助消化类功能学评价人体试验； 8) 第 8 部分：胃肠功能保健-通便类功能学评价动物试验； 9) 第 9 部分：胃肠功能保健-通便类功能学评价人体试验； 10) 第 10 部分：皮肤瘙痒类功能学评价动物试验； 11) 第 11 部分：皮肤瘙痒类功能学评价人体试验； 12) 第 12 部分：妇女卫生保健类功能学评价动物试验； 13) 第 13 部分：妇女卫生保健类功能学评价人体试验；

5、 14) 第 14 部分：眼部保健类功能学评价人体试验； 15) 第 15 部分：改善睡眠、醒脑通窍保健类功能学评价动物试验； 16) 第 16 部分：改善睡眠、醒脑通窍保健类功能学评价人体试验。 c) DB61/T 1000保健用品产品标准编写规范分为以下 8 个部分： 1) 第 1 部分：总则； DB61/T 1001.22015 III 2) 第 2 部分：保健贴类产品标准编写规范； 3) 第 3 部分：眼贴类产品标准编写规范； 4) 第 4 部分：含药芯类产品标准编写规范； 5) 第 5 部分：喷涂类产品标准编写规范； 6) 第 6 部分：清洗液类产品标准编写规范； 7) 第 7 部分

6、：器具类产品标准编写规范； 8) 第 8 部分：功能服装类产品标准编写规范。 本部分根据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本部分由陕西省食品药品监督管理局提出并归口。 本部分起草单位：陕西省食品药品监督管理局、陕西省质量技术监督局。 本部分主要起草人：杨晓莉、乔蓉霞、李伟、张扬。 本部分由陕西省食品药品监督管理局负责解释。 本部分首次发布。 联系信息如下： 单位：陕西省食品药品监督管理局 电话：029-62288000 地址：西安市高新六路56号 邮编：710065 DB61/T 1001.22015 1 保健用品微生物限度检查 第 2 部分：菌落总数测定 1 范围 DB61/T 1

7、001的本部分规定了保健用品中菌落总数的测定方法。 本部分适用于陕西省的保健用品中菌落总数的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB61/T 1001.1-2015 保健用品微生物限度检查 第1部分：总则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 菌落总数 bacterial colony count 指保健用品经过处理，在一定条件下培养后（如涉及培养基成份、培养温度、培养时间、pH值、需 氧性质等因素），每1g、1mL或10c

8、m 2 检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下 生长的嗜中温的需氧性菌落总数。 4 设备和材料 对保健用品送检样品进行菌落总数测定时，除应具备微生物实验室的常规灭菌和培养设备外，还应 配备以下设备和材料并符合其规定： a) 恒温培养箱：温度应控制在 36 1； b) 冰箱：温度应控制在 25； c) 恒温水浴箱：温度应控制在 46 1； d) 天平：感量为 0.1g； e) 振荡器； f) 均质器； g) 无菌吸管 1mL（具 0.01mL 刻度）、10 mL（具 0. 1mL 刻度），或微量移液器及吸头； h) 无菌锥形瓶：容量为 250mL 或 500 mL； i) 无

9、菌培养皿：直径为 90mm； j) pH 计或精密 pH 试纸； k) 放大镜或/和菌落计数器。 5 培养基和试剂 DB61/T 1001.22015 2 5.1 无菌生理盐水 无菌生理盐水应符合DB61/T 1001.1-2 015中3.6.3规定的要求。 5.2 卵磷脂、聚山梨酯 80-营养琼脂培养基制备 应先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入聚山梨酯80，将除琼脂外的其他成份加入剩余的 蒸馏水中进行溶解。再加入已溶解的卵磷脂、聚山梨酯80，混匀，调节pH值至7.17.4，灭菌，储存于 冷暗处备用。其中，各制备材料的种类及量应符合以下要求： a) 蛋白胨：20g； b) 牛肉膏：3g

10、； c) 氯化钠：5g； d) 琼脂：15g； e) 卵磷脂：1g； f) 聚山梨酯 80：7g； g) 蒸馏水：1000mL。 5.3 0.5氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride，TTC）制备 应称取0.5g TTC、100mL蒸馏水，将其溶解后过滤，灭菌，装于棕色试剂瓶，置于4冰箱备用。 6 操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 应按照 DB61/T 1001.1-201 5 中 4.4 的规定制备 1：10 样品匀液。 6.1.2 应称取 1mL 的 1：10 样品匀液沿管壁缓慢注于盛有 9mL 无菌生理盐水的试管中（注意吸管不得 接

11、触液面），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1：100 样品匀液。 6.1.3 应按照 6.1.2 规定的要求，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增一次，应换用 1 次 1mL 无菌吸 管或吸头。 6.1.4 应根据对样品污染状况的估计， 选择 2 个3 个适宜稀释度的样品匀液 （液体样品可包括原液） ， 在进行 10 倍递增稀释时，吸取 1mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度应至少做两个平皿。同时，应 分别吸取 1mL 空白稀释液加入两个平皿内作空白对照。 6.1.5 应及时将 15mL20mL 冷却至 46的卵磷脂聚山梨酯-80 营养琼脂培养基 （可放置于 46

12、1 恒温水浴箱中保温）倾注于平皿，并转动平皿使其混合均匀。 6.2 培养 6.2.1 应在琼脂凝固后翻转平板，并在 361条件下培养 3d。 6.2.2 为便于区别样品中的颗粒与菌落，可在每 100mL 卵磷脂聚山梨酯 80-营养琼脂中加入 1mL 0.5 的 TTC 溶液：若有细菌存在，则培养后菌落呈红色，而样品的颗粒颜色无变化。 6.3 菌落计数方法 6.3.1 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，并应记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计 数应以菌落形成单位（colony-forming units，即 CFU）表示。 DB61/T 1001.22015 3 6.3.2 应选取菌落数

13、在 30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。对于菌落数低 于 30 CFU 的平板应记录其具体菌落数，对于菌落数大于 300 CFU 的平板可记录为“多不可计”。每个 稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数计数。 6.3.3 若其中一个平板有较大片状菌落生长，则不宜采用该平板计数菌落数，而应采用无片状菌落生 长的平板计数该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半的菌落分布又很均匀，则可 计数无片状菌落的半个平板后乘以 2，代表一个平板菌落数。 6.3.4 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，应将每条单链作为一个菌落计数。 7 结果和报告 7.1 菌落

14、总数的计算方法 7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，则应计算两个平板菌落数的平均值，再 将平均值乘以相应稀释倍数进行结果计算。 7.1.2 若有两个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，则应求出两菌落总数之比值来决定：若其 比值小于或等于 2，则应报告其平均数；若其比值大于 2，则应报告其中稀释度较低的平板菌落数。 7.1.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于 300CFU，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数进行 结果计算。 7.1.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于 30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数进行 结果计算。 7.1.5 当所有稀释度的平

15、均菌落数均不在 30 CFU300 CFU 之间时，若其中一个稀释度的平均菌落数 大于 300 CFU，而相邻的另一个稀释度的平均菌落数小于 30 CFU，则应以 更接近 30 CFU 或 300 CFU 的 平均菌落数乘以稀释倍数进行结果计算。 7.1.6 当所有稀释度的平板均无菌生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但其平均菌落数小于 1 CFU 时，应以1 乘以最低稀释倍数进行结果计算。 7.2 菌落总数的报告 7.2.1 当菌落数小于 100 CFU 时，应按“四舍五入”原则修约，以整数报告。 7.2.2 当菌落数大于或等于 100 CFU 时，应对第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数 字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，取前 2 位有效数 字。 7.2.3 当所有平板上为蔓延菌落而无法计数时，应报告菌落蔓延。 7.2.4 若空白对照平板上有菌落生长，则应判定该次检测结果无效。 7.2.5 若检测结果超过本标准规定的要求，则应再取同批号样品连续检测两次，用三次检测结果的平 均值报告菌落总数。 _