DB51 T 2521-2018 蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病诊断技术规程.pdf

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1、1 ICS 65.150 B 52 DB51 四川省地方标准 DB51/T 25212018 蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病诊断技术规程 2018 - 07 - 23 发布 2018 - 08 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 25212018 I 目 次 前 言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 试剂和材料 . . 1 5 设备和器械 . . 2 6 临床检查 . . 2 7 实验室样品采集 . . 2 8 细菌分离与纯化 . . 2 9 细菌鉴定 . . 2 10 结果判定 . . 4 11 综合判定 .

2、. 5 附录 A（规范性附录） 试 剂 配 方. . 6 附录 B（资料性附录） 脑膜炎败血伊丽莎白菌 16S rR NA 基因参考序列（1450bp） . 9 DB51/T 25212018 II 前 言 本标准依据 GB/T 1.12009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川农业大学。 本标准起草人：耿毅、陈德芳、郑李平、黄小丽、欧阳萍、白明焕、王世震。 DB51/T 25212018 1 蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了蛙脑膜炎败血伊

3、丽莎白菌病诊断的术语与定义、 试剂和材料、 设备和器械、 临床检查、 实验室样品采集、细菌分离与纯化、细菌鉴定、结果判定和综合判定等技术规程。 本标准适用于牛蛙( Rana catesdeiana)、 美国青蛙( Rana grylio)、 虎纹蛙( Rana tigrina rugulosa)、 黑斑蛙 (Rana gotiath)、棘胸蛙( Rana spinosa)、林蛙( Rana sylvatica)等蛙类脑膜炎败血伊丽莎白菌 病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于文件的应用时必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包

4、括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检测 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检测方法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。 3.1 蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病 是指由脑膜炎败血伊丽莎白菌( Elizabethkingia meningoseptica)感染引起的蛙类发病或死亡的 一种细菌性疾病。 3.2 BHI Brain Heart Infusion 脑心浸液琼脂培养基。 3.

5、3 16S rRNA 16S ribosomal RNA 基因 16S核糖体RNA基因。 4 试剂和材料 4.1 试剂、染色液与培养基 DB51/T 25212018 2 按GB/T 4789.28、GB/T 18652与S C/T 7014规定执行。Taq酶、dNTPs、10 PCR缓冲液（无Mg 2+ ）、 DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒等选用专业试剂公司提供的商品化试剂，上述未提及的见附录 A。 4.2 水 应符合GB/T 6682 中一级水的规格。 4.3 引物 16S rRNA基因DNA序列扩增引物，F：5 -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3，R：5

6、-TAC GGT TAC CTT GTT ACG AC-3，-20保存。 5 设备和器械 主要设备与器械如下： 解剖盘、剪刀、镊子、手术刀、培养皿、铂耳、酒精灯、普通光学显微镜、电子天平、高压灭菌锅、 恒温培养箱、超净工作台、普通冰箱、高速冷冻离心机、微量移液器、PCR扩增仪、离心管和PCR管、水 平电泳系统和凝胶成像系统等。 6 临床检查 6.1 临床症状 病蛙体色发黑，厌食懒动，运动机能失调，头部歪斜，游动失去平衡或浮于水面间隙性旋转。 6.2 外部检查 病蛙眼角膜发白，呈“白内障”表现，肛门红肿；四肢肿胀，后肢内侧充血、出血发红，腹部膨胀； 部分病蛙体表出现溃疡。 6.3 剖检 腹腔内大

7、量淡黄色腹水，肝、脾、肾肿大，淤血、出血，胆囊扩张，胆汁充盈；肠道充血，肠腔无 食物，其内充滞多少不等的黏液。 7 实验室样品采集 样品采集按SC/T 7103 规定执行。 8 细菌分离与纯化 在无菌的环境中， 从病蛙的肝、 肾中直接取样， 按常规法划线接种脑心浸液琼脂培养基 （Brain Heart Infusion, BHI）（A.1）。 28培养36h48h后，挑取表面光滑湿润、微隆起、质地较软、边缘整齐、 不透明、圆形的淡黄色优势菌落划线接种在BHI平板进行纯化培养。 9 细菌鉴定 DB51/T 25212018 3 9.1 革兰氏染色 按GB/T 4789.28中2.2的规定执行。

8、9.2 生理生化试验 9.2.1 精氨酸双水解酶试验 将待检菌穿刺接种在精氨酸双水解酶培养基（A. 2）上。2 8培养48h。菌落周围培养基出现粉红 色晕圈为阳性，无粉红色晕圈为阴性。 9.2.2 七叶苷水解试验 将待检菌接种于七叶苷培养基平板（A.3）上，35培养24h。培养基变黑为阳性；不变为阴性。 9.2.3 氧化酶试验 以毛细管吸取四甲基对二苯胺的1水溶液滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性； 不变色为阴性。 9.2.4 DNA 酶试验 将待检菌接种于DNA酶培养基平板（A.4）上，28 培养48h。菌落周围培养基出现粉红色晕圈为阳 性；无晕圈为阴性。 9.2.5 过氧化氢酶

9、（接触酶）试验 按SC/T 7014表2的接触酶试验的规定执行。有气泡产生为阳性；无气泡产生为阴性。 9.2.6 乙酰甲基甲醇（V-P）试验 按SC/T 7014表2的乙酰甲基甲醇（ V-P）试验的规定执行。培养基下层出 现红色为阳性，不出现红 色为阴性。 9.2.7 甲基红（MR）试验 按SC/T 7014表2的甲基红（MR）试验的规定执行。培养基变红为阳性；不变红为阴性。 9.2.8 柠檬酸盐试验 按GB/T 4789.28中3.7的规定执行。培养基由绿色变为蓝色为阳性；不变蓝色为阴性。 9.2.9 吲哚试验 按SC/T 7014表2的吲哚试验的规定执行。培养基变红为阳性；不变红为阴性。

10、9.2.10 鸟氨酸脱羧酶试验 按GB/T 4789.28中3.12的规定执行。培养基呈紫色为阳性，对照管培养基为黄色。 9.2.11 糖、醇类（葡萄糖、甘露醇）发酵试验 将待检菌穿刺接种于糖、醇类发酵试验培养基（A. 5），28培养24h后观察。培养基变黄为阳性， 不变黄为阴性。 DB51/T 25212018 4 9.3 16S rRNA 基因 DNA 的序列测定和同源性分析 9.3.1 细菌基因组 DNA 提取 取2mL待检菌培养液，12000 r/min离心1min，收集菌体；菌体悬浮于500 L TE缓冲液（pH8.0）（A. 6），震荡悬浮，加入50 L 10的SDS溶液（A. 7

11、），10 L 20mg/mL的蛋白酶K（A. 8），混匀，37 温育1h；加入100 L 5mol/L的NaCl溶液（A. 9），充分混匀，再加入100 L CTAB/NaCl溶液（A. 10） 混匀，65温育20min；加入等体积的酚氯仿异戊醇（25:24:1）（A. 11），混匀，12000 r/min 离心5min；取上清液加入等体积的氯仿异戊醇（24:1）（A. 12），混匀，12000 r/min离心5min；取 上清液，加入1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置10min，10000 r/min离心10min；沉淀用70酒精 洗涤2次，室温晾干；加入50 L的TE缓冲液溶解，-20贮

12、存，备用。 9.3.2 16S rRNA 基因 PCR 扩增 PCR扩增体系：在PCR管中加入10 PCR缓冲液（无Mg 2+ ）5.0 L，MgCl 2（25mmol/L）5.0 L，dNTP s （10mmol/L）1.0 L，引物(20 mol/L) F和R各1.0 L，Taq DNA酶（5U/ L）0.5 L，DNA模板1.0 L，无 菌双蒸水补足至50 L。混匀后，3000 r/min离心30s。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA 模板。 PCR扩增程序：94预变性5min；94变性1min， 54退火1min，72延伸1min；共35个循环；最 后72延伸10min；4

13、保温。 9.3.3 琼脂糖凝胶电泳 用TAE电泳缓冲液（A. 13）配制1的琼脂糖平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹 没胶面。将上述6 L样品和2 L溴酚蓝指示剂溶液（A. 14）混合后加入样品孔，使用DNA分子量标准参 照物作对照。120V电泳约20min，当溴酚蓝到达底部时停止，于紫外光下观察约1500bp的目的条带。 9.3.4 PCR 扩增产物纯化、测序及序列比对 9.3.4.1 PCR 扩增产物纯化 9.3.4.1.1 在长波紫外灯下用刀片切下含目的条带（约 1500bp）的胶块，放入无菌离心管中称重； 9.3.4.1.2 按每 0.1g 琼脂糖凝胶加 0.1mL 酚，将

14、酚加入 9.3.3 含有目的条带胶块的离心管中，漩涡震 荡仪震荡 1min2min，将离心管在-70放置 1h，使凝胶完全冻结； 9.3.4.1.3 37水浴将冻结的凝胶融化后，在漩涡震荡仪上震荡 1min2min；14000r/min 离心 5min， 取上层水相转入另一个离心管中， 加入等体积的酚氯仿异戊醇 （25:24:1） （A. 11） ， 混匀， 12000r/min 离心 5min； 9.3.4.1.4 取上清液加入等体积的氯仿异戊醇（24:1）（A12），混匀，120 00r/min 离心 5min； 9.3.4.1.5 向收集的水溶液中加入 1/10 体积的 3mol/L 的

15、乙酸钠和 2 倍体积的无水乙醇， -20过夜或 -70放置 1h2h； 9.3.4.1.6 14000r/min 离心 10min，弃上清，将沉淀的 DNA 溶于适当体积的 TE 缓冲液（A. 6）中，置 -20保存，待测。 9.3.4.2 PCR 扩增产物测序与同源性分析 将9.3.4.1纯化的PCR扩增产物进行序列测定，并与参考序列（附录B）进行比对分析。 10 结果判定 DB51/T 25212018 5 10.1 菌落形态 28培养36h48h，形成表面光滑湿润、微隆起、质地较软、边缘整齐、不透明、圆形的淡黄色菌 落。 10.2 细菌染色 革兰氏染色为阴性，两端钝圆的短直杆菌。 10.

16、3 生理生化试验 生理生化反应试验结果见表1。 表1 蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌的生理生化反应结果 反应项目 结果 反应项目 结果 反应项目 结果 精氨酸 + 过氧化氢酶 + 吲哚 - 七叶苷 + V-P - 鸟氨酸脱氢酶 - 氧化酶 + 甲基红 - 葡萄糖 + DNA 酶 + 柠檬酸盐 - 甘露醇 + 注： “ +”为阳性， “ -”为阴性。 10.4 16S rRNA 基因 DNA 的序列测定和同源性分析 测定的16S rRNA基因DNA序列与附录B所列的基因序列进行b last比较，同源性达96%以上。 11 综合判定 符合以下所有特征者判定为蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病： a) 临床症状与 6

17、 相符； b) 菌落形态和染色观察与 10.1 和 10.2 相符； c) 生理生化反应结果与 10.3 相符； d) 16S rRNA 基因 DNA 的序列测定和同源性分析结果与 10.4 相符。 DB51/T 25212018 6 A A 附 录 A （规范性附录） 试 剂 配 方 A.1 脑心浸液琼脂 蛋白胨 10.0g 脱水小牛脑浸粉 12.5g 脱水牛心浸粉 5.0g 氯化钠 5.0g 葡萄糖 2.0g 磷酸氢二钠 2.5g 琼脂粉 20g 加热搅拌溶解于1000ml蒸馏水中,121 灭菌15min，倒平板。 A.2 精氨酸双水解酶培养基 蛋白胨 1g NaCl 5g K2HPO4

18、0.3g 酚红 0.01g 琼脂 6g L-精氨酸盐 10g 蒸馏水 1000mL pH7.0-7.2，分装试管，培养基高度约4.5cm，121灭菌15min。 A.3 七叶苷水解试验 蛋白胨 5g 七叶苷 3g K2HPO4 1g 枸橼酸铁 0.5g 琼脂 15g 蒸馏水 1000Ml A.4 DNA酶试验培养基 酪朊水解物 15g 大豆蛋白胨 5g NaCl 5g DNA 2g DB51/T 25212018 7 甲苯胺蓝 0.1g 琼脂 15g 蒸馏水 1000mL 除DNA和甲苯胺蓝之外的成分，加热熔化后调pH至7.2.加入DNA和甲苯胺蓝，混匀后分装，121灭 菌30min。 A.5

19、 糖、醇类发酵培养基 蛋白胨 2g NaCl 5g K2HPO4 0.2g 被测糖或醇类 10g 琼脂 6g 溴百里酚蓝1水溶液 3mL （溴百里酚蓝先用少量95乙醇溶解后，再加水配制1的水溶液） 蒸馏水 1000mL pH7.0-7.2，分装试管，培养基高度约4.5cm，115灭菌20min。 A.6 TE缓冲液（pH8.0） 将0.121g Tris碱（分子量121.1），0.0 372g乙二胺四乙酸二钠（分子量372.24）加入80mL双蒸水 中，加浓盐酸调节pH至8.0，加双蒸水定容至100mL，室温保存。 A.7 10SDS溶液 将10g十二烷基硫酸钠加入80mL双蒸水中， 加热至6

20、8助溶， 再加入双蒸水定容至100mL， 室温保存。 A.8 蛋白酶K（20mg/mL） 将蛋白酶K溶解于双蒸水中，至终浓度20mg/mL，分装入小管，置-20保存。 A.9 5mol/L的NaCl溶液 将29.22g NaCl（分子量58.44 ）溶解于80mL双蒸水中，再加双蒸水定容至100mL，室温保存。 A.10 CTAB/NaCl溶液 4.1g NaCl溶解于80mL双蒸水中，缓慢加入1 0g CTAB，再加双蒸水定容至100mL，室温保存。 A.11 酚氯仿异戊醇（25241） 将25体积的酚、24体积的氯仿和1体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中，上面加上TE 缓冲液，4

21、保存。 DB51/T 25212018 8 A.12 氯仿异戊醇（241） 将24体积的氯仿和1体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中。 A.13 50TAE电泳缓冲液 在400mL双蒸水中溶解121g Tris碱，加入28.55mL冰乙酸和50ml 0.5/L EDTA。再加双蒸水定容至 500mL，室温保存。使用时，配成1 TAE电泳缓冲液。 A.14 溴酚蓝指示剂溶液 6 上样缓冲液 将溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜。 待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴 酚蓝溶液中，摇匀后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，调至蓝色。 DB51/T 25212018

22、9 B B 附 录 B （资料性附录） 脑膜炎败血伊丽莎白菌 16S rRNA 基因参考序列（1450bp） 1 ccggggggcg ggggtgctat acatgcaagt agaacgctga ggtttggtgt ttacactaga 61 ctgatgagtt gcgaacgggt gagtaacgcg taggtaacct gcctcatagc gggggataac 121 tattggaaac gatagctaat accgcataag agtaattaac acatgttagt tatttaaaag 181 gagcaattgc ttcactgtga gatggacctg c

23、gttgtatta gctagttggt gaggtaaagg 241 ctcaccaagg cgaaccgata acatagcccg acctgagaag ggtgatcggy cacactggra 301 ctgagacacg gcycagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcgk caatggacgg 361 aagtctgayc gagcawcgcc gcgtgagtga mgaasgtttt cggatcgtaa agctctgttg 421 ttagagaaga acgttggtag gagtggaaaa tctaccaagt gacggtaact

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26、tgaccggc ctagagatag gctttctctt cggagcagaa 1021 gtgacaggtg rtgcatggyt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttkggk taagtcccgc 1081 aacgagcgca acccctatyg ttagttgcca tcawtaagtt gggcactcta gcgagactgc 1141 cggtaataaa ccggagraag gtgkgkatga cgtcwaatca tcatgcccct tatgacctgg 1201 sctacaccac gtgctacaat ggttggtaca acgagtcgca agccggtgac ggcaagctaa 1261 tctcttaaag ccaatctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagtcggaa 1321 tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1381 gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc 1441 agccgcctaa gtgcataatt _ DB51/T 25212018