DB21 T 1749.3-2009 《黄瓜绿斑驳花叶病毒检验检测技术规程》.pdf

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1、 ICS 备案号： 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21 DB21/T 1749.3 2009 黄瓜绿斑驳花叶病毒检验检测技术规程 2009-10-23 发布 2009-11-23 实施 辽宁省质量技术监督局 发布 DB21/T 1749.3 2009 I 前 言 本标准附录 A、附录 B、附录 C、附录 D、附录 E 为规范性附录。 本标准由辽宁省农村经济委员会提出并归口。 本标准起草单位：辽宁省植物保护站。 本标准主要起草人： 蔡 明、宋雅坤、吴元华、李明福、江 冬、李 眷、李维根。 DB21/T 1749.3 2009 1 黄瓜绿斑驳花叶病毒检验检测技术规程 1 范围 本标准规定了 黄瓜

2、绿斑驳花叶病毒 （ Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV） 的检验检测与鉴定方法。 本标准适用于全省各地开展黄瓜绿斑驳花叶病毒的检验检测工作 。 2 术语和定义 下列 术语和定义适用于本标准。 2.1 检验 inspection 对植物 、植物产品或其他限定物进行官方的直观检查以确定是否存在有害生物和 /或是否符合植物检疫法规。 2.2 检测 detection 为确定是否存在有害生物或为鉴定有害生物而进行的除肉眼检查以外的官方检查 。 2.3 鉴定 identification 对可疑的有害生物是否与已知物种同一的鉴别过程 。 2.4 发生 ha

3、ppen 官方报道在一个地区存在着土生或传入的有害生物 ，和 /或官方未报道在一个地区存在的有害生物已经被根除。 3 原理 黄瓜绿斑驳花叶病毒 属烟草花叶病毒属。 其病原形态特征见附录 A，其寄主范围、地理分布、生物学特性、危害症状和传播途径见附录 B，其血清学检测技术，应用双抗体夹心酶联免疫吸附法技术（ ELISA）测定和分子生物学（ PCR）测定，具体检测方法见附录 C、附录 D。 4 材料、仪器、 用具及药品 4.1 材料 葫芦科作物种子 、叶片和果实。 4.2 仪器、用具 电子显微镜 、台式离心机、分光光度计、 RT-PCR仪、冰箱、酶联板、酶联读数仪、微量加样 器、洗瓶、载玻片、玻棒

4、、研钵、微量离心管、培养皿、打孔器、滴管、吸管、量筒、三角瓶、水浴锅、毛细管、针头、电泳仪、水平电泳槽、胶手套、剪刀 、镊子、自封袋、油性笔、标签、记录本等。 4.3 药品 专化性抗体免疫球蛋白 1gG(浓度约为 1mg/mL)、酶标记羊抗兔抗体球蛋白 1gG(市售 )、碳酸钠 (无水 )、碳酸氢钠、叠氮化钠、磷酸氢二钠 (无水 )、磷酸二氢钾 (无水 )、氯化钠、氯化钾、 Tween-20、鸡蛋清粉、聚乙烯吡咯烷酮、亚硫酸钠 (无水 )、牛血清白蛋白、二乙醇胺、氯化镁等。 DB21/T 1749.3 2009 2 5 现场检验鉴定 5.1 种子检查 在 11月翌年 2月份对市场销售的葫芦科作

5、物种子和砧木种子进行扦样，每份样品取 100粒，送指定的有关部门进行检测。重点检查用做砧木的种子。 5.2 田间调查 3月 10月份在黄瓜绿斑驳花叶病毒的发生期，选择有代表性地块，检查叶片、果梗、果实，看叶片上是否出现黄绿相间斑驳、隆起、皱缩、蕨叶，果梗是否有褐色条斑，果实表面是否有斑驳、凸起，果实内部是否有空洞、黄丝、果肉暗红倒瓤等。 5.3 症状检验 从植株上摘取病叶或果实，与附录 B记述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的为害症状进行比较，符合附录 B记述的黄瓜绿斑驳病毒为害症状的为疑似病株。或在调查现场将病叶取下，用快速诊断试纸条或诊断试剂盒（附录 E）进行初步诊断。 5.4 病害发生分级标准 (以

6、株为单位 ) 0级 ： 无任何症状； 1级 ： 心叶明脉，轻微花叶 ，发病面积占整个植株面积的 5%以下； 3级 ： 心叶及少数叶片花叶，发病面积占整个植株面积的 6 15%； 5级 ： 多数叶片花叶，少数叶片皱缩、畸形，植株轻微矮化，发病面积占整个植株面积的 16%30%； 7级 ： 多数叶片严重花叶，多数叶片皱缩、畸形，植株矮化，或叶柄有褐色坏死斑点，发病面积占整个植株面积的 31% 50%； 9级 ： 严重发病，叶片严重畸形，植株严重矮化，茎部有褐色条斑，发病面积占整个植株面积的 51%。以上。 5.5 病情指数 按下式 计算。 100)( IN inDi （ 1） 式中： Di 病情指

7、数； n 各级病株数； N 该病级数； i 调查总株数； I 最高级数。 6 实验室检测鉴定 经现场检验检测，不能确定为黄瓜绿斑驳花叶病毒的，取样带回实验室进行检测鉴定。 6.1 取样方法 在发病植株上，随机选取发病叶片或果实（其数量以满足检测鉴定所需 为限），装入聚乙烯塑料袋中密封，贴好标签带回。标签应注明采集时间、地点、采集人等信息。对所采集的样本，应放入低温（ 4 ）密闭保存，要尽早进行鉴定。 6.2 病毒鉴定 将所采集的样本进行血清学检测技术 （ ELISA）或分子生物学技术（ PCR）测定，将检测结果与附录A记述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的病原特征进行比较，符合附录 A记述的黄瓜绿斑驳花叶

8、病毒病原特征的，确定为黄瓜绿斑驳花叶病毒。 DB21/T 1749.3 2009 3 7 标本保存 7.1 应配有田间调查的植株、叶片、花、果实等资料，症状照片 ;当地专家的初步鉴定或识别结果。 7.2 样品采集应以幼嫩叶片为主，特殊材料可以根据具 体情况灵活掌握，样品数量不少于 200g/份，每个标样 2份，提倡冻干样品（冷冻样品），送指定的专家鉴定。 7.3 当地设法保存活体样品，以备应急使用。 7.4 适合压制的叶片标本，应随采随压于标本夹中。 7.5 记载寄主名称、发病情况、环境条件、采集地点、采集日期、采集人姓名等。 DB21/T 1749.3 2009 4 附 录 A （资料性附录

9、） 黄瓜绿斑驳花叶病毒分类命名和病原特征 A.1 分类和命名 A.1.1 学名 Cucumber green mottle mosaic virus（ CGMMV） A.1.2 分类地位 烟草花叶病毒属 (Tobamovirus) A.1.3 病毒异名 Tobacco mosaic virus watermelon strain,Cucumber virus 3,Cucumber virus 4, Cucumid virus 2 A.2 病原特征 A.2.1 病毒粒子 直棒状病毒，长 300nm，宽 15nm 。沉淀系数 185S。等电点 pH4.98； A260/280 1.38。 A.2.

10、2 核酸 核酸含量 5，单链 RNA，分子量 2106。 G:A:C:U=23.2:24.6:20.6:31.6。 A.2.3蛋白 蛋白含量 95，分子量 17261。氨基酸 160，其组成为 Ala21、 Arg8、 Asp20、 Cys0、 Glu10、 Gly9、His1、 Ile7、 Leu18、 Lys4、 Met0、 Phe9、 Pro6、 Ser24、 Thr10、 Trp2、 Tyr4、 Val7。 A.2.4 病毒株系 根据不同分离物的血清学反应及其对 苋色藜和 蔓陀罗的症状反应，将其分为以下株系。 主要有 英国和欧洲报道的 典型株系（ Ainsworth, 1935） ，日

11、本报道的黄瓜株系（ cucumber strain） 、西瓜株系（ Watermelon strain） 和 Yodo 株系 （ Yodo strain） ，以及 印度 C 株系 (Hollings et al.， 1975)。 DB21/T 1749.3 2009 5 附录 B (资料性附录 ) 黄瓜绿斑驳花叶病毒的寄主范围、地理分布、生物学特性、为害症状、传播途径及鉴别寄主 B.1 寄主范围 B.1.1 自然寄主 西瓜、南瓜、甜瓜、黄瓜、葫芦、西葫芦、瓠瓜。 B.1.2 寄主范围 苋色藜、 蔓陀罗、 甜瓜、笋瓜、西葫芦、葫芦、丝瓜、烟草 。 B.2 地理分布 目前， CGMMV 在世界已广

12、泛分布，欧洲的英国、爱尔 兰、德国、荷兰、丹麦、俄罗斯、希腊、奥地利、捷克、斯洛伐克、芬兰、南斯拉夫、罗马尼亚、摩尔多瓦、波兰、乌克兰、拉托维亚、保加利亚、捷克、匈牙利、西班牙、瑞典；南美洲的巴西；亚洲的日本 ( Yodo、 Ibaraki、松山、德岛、北海道、千叶 )、印度 (Uttar-Pradesh、 Delhi)、韩国、巴基斯坦 (西北部边境省份 )、以色列、沙特阿拉伯、伊朗、朝鲜及 我国的辽宁、河北、山东、广东、湖北等省发生。 B.3 生物学特性 B.3.1 致死温度 黄瓜绿斑驳花叶病毒的致死温度为 90 100 B.3.2 稀释限 点 黄瓜绿斑驳花叶病毒的稀释限点 为 10-6 1

13、0-7 mL/L B.3.3 体外存活期 体外存活期较长， 达 119d 以上 。 在 0 可保持数年， 20 病毒仍能存活 。 病毒在种子内可存活240d 540d， 病残体 在土壤内 深埋 420d，病毒仍有侵染活性 。 B.3.4 病毒 粒体形态 电镜 观察 病毒粒体为棒状，长约 300nm， 宽 15nm。 B.4 为害症状 B.4.1 西瓜染病症状 幼叶出现淡黄色花叶，其后出现斑驳、花叶、叶脉绿带状、浓绿凹凸斑等，随叶片老化症状减轻。有时也呈叶脉绿带状。果实表面浓绿圆斑，果蒂处有时坏 死，种子周围的果肉呈赤紫色水渍状，成熟时变为暗褐色出现空洞，并且呈丝状纤维化， 腐烂变味，不能食用。

14、 B.4.2 甜瓜染病症状 感病后茎端新叶出现黄斑，但随新叶老化症状减轻。 成株侧枝叶出现不整形或星状黄花叶，生育后期顶部叶片有时再现大型黄色轮斑。果实有两类症状，一种在 果实表面出现 绿色斑。另一种在绿色部的中心出现灰白色部分。 B.4.3 黄瓜染病症状 感病初期 新叶出现黄色小斑点 ，以后黄色部分扩展成花叶，并发生浓绿瘤状突起，出现叶脉绿带。发病轻时 果实只 出现 淡黄色圆形小斑点， 严重时 出现浓绿色瘤状突起变成畸形 。 B.5 传播途径 B.5.1 传播方法 CGMMV 有多种传播方式 ： 1.种子传播； 2.接触传染（包括 植物间接触、农事操作、汁液 ）； 3.介体DB21/T 17

15、49.3 2009 6 传毒（如 菟丝子 、 黄瓜叶甲 ）； 4.花粉传毒； 5.病残体 6.其他（ 啮齿动物的粪便、栽培营养液、河水、灌溉水、被污染的包装容器、用作肥料的牛粪 ）。 其中带毒种子是远距离传播主要途径。接触性传染是近距离传播主要途径。 B.5.2.2 侵染循环 该病毒在种子、病株残体 、土壤 中均可越冬，成为第二年的初侵染来源。带毒种子是主要 初 侵染源。在田间， CGMMV 能很容易地通过病株的汁液接触 传播， 人工 嫁接和授粉等方式 易再 传染 。 因此，田间农事操作如 整枝、上架、摘心、授粉、嫁接、摘果均可 导致该病毒的再次传播。 B.5.3 流行与环境 发病受温度影响，

16、在 16 时 侵染至 发病 需 2 3周， 显 病 较 轻 ； 在 28 35 下接种 1周即可发病，症 状 重。 CGMMV适生性和抗逆性极强，所有株系都是极端稳定的，其致死温度 90 100 ，稀释限点10-6 10-7，常温下病毒侵染力可保持数月，在 0 可保持数年， 20 病毒仍能存活，一旦条件适宜还能继续传播蔓延。田间一旦发病，如未进行特殊的杀灭处理，病株残体中的病毒可存活多 年，即便将病根埋在土壤内 365d以上，病毒仍保持侵染能力。 B.6 鉴别寄主 B.6.1 黄瓜 新叶出现黄色小斑点，后呈花叶并带有浓绿色突起，叶脉间褪色呈叶脉绿带状。 B.6.2 西瓜 茎端幼叶出现淡黄色花叶

17、，其后出现浓绿凸凹斑，随叶片老化症状减轻。果实表面浓绿圆斑，中央有坏死点，种子周围的果肉呈赤紫色水渍状，成熟时变为暗褐色出现空洞。 B.6.3 甜瓜 新叶出现黄斑，但随叶片老化呈叶脉绿带状。 B.6.4 瓠瓜 叶片出现花叶，有绿色突起，脉间黄化呈叶脉绿带状。 B6.5 葫芦 幼叶出现淡黄色花叶， 其后出现浓绿凹凸斑，随叶片老化症状减轻。 B.6.5 苋色藜 经西瓜株系、 Yodo 株系和印度 C 株系侵染后出现细小局部坏死斑，而欧洲黄瓜株系不出现这种症状；无系统侵染。 B.6.6 蔓陀 罗 Yodo 株系和日本的黄瓜株系在接种后 7d 产生能扩散的局部褪绿斑；无系统侵染。 DB21/T 174

18、9.3 2009 7 附录 C (规范性附录 ) 黄瓜绿斑驳花叶病毒双抗体夹心酶联免疫吸附测定（ Double antibody sandwich ELISA）标准 C.1 仪器和用具 C.1.1 仪器设备 离心机、 电子天平 （ 1/10 000g） 、 酶标仪 等。 C.1.2 用具 可调移液器 （ 20L 200L、 200L 1000L）及相关吸 头、 研钵、离心管（ 1.5mL、 10mL）、量筒、烧杯 等 。 C.2 试剂 C.2.1 包被缓冲液 无水碳酸钠 1.59g， 碳酸氢钠 2.93g， 叠氮化钠 0.2g， 蒸馏水 定容至 1000mL，调整 pH 至 9.6， 4贮存。

19、 C.2 2 洗涤缓冲液（ PBST） 磷酸氢二钠（无水） 1.15g 或 磷酸氢二钠（十二水） 2.9g， 磷酸二氢钾（无水 ） 0.2g， 氯化钠 8.0g，氯化钾 0.2g， 吐温 -20 0.5g 蒸馏 水定容至 1000mL，调整 pH 至 7.4，室温贮存。 C.2.3 提取缓冲液 鸡蛋清粉 2.0g， PVP （分子量 24-40,000） 20.0g， 无水亚硫酸钠 1.3g， 叠氮化钠 0.2g， 吐温 -20 20.0g 溶解于 1000mL 1X PBST 中，调整 pH 至 7.4， 4 贮存。 C.2.4 酶标抗体缓冲液 牛血清蛋白 2.0g， PVP（分子量 24-

20、40,000） 10.0g， 叠氮化钠 0.2g， 溶解于 1000mL 1X PBST中，调 整 pH 至 7.4， 4 贮存。 C.2.5 底物缓冲液 二乙醇胺 97.0mL， 氯化镁 0.1g， 叠氮化钠 0.2g， 蒸馏水 定容至 800mL，调 整 pH 至 9.8， 4 贮存。 C.3 取样方法 C.3.1 种子 取 若干 粒种子，去皮，加入样品提取缓冲液（ W/V=1： 8）研磨匀浆，离心后 4 保存待用。 C.3.2 叶片 取叶片加入提取缓冲液 （ W/V=1： 8）研磨匀浆。离心后 4 保存待用。 C.4 DAS-ELISA检测程序 C.4.1 包被 将 CGMMV 的包被抗

21、体按 照试剂盒指定稀释比例用包被抗体缓冲液稀释，混匀 ，加入酶联板中 ，每孔内加入 100 L， 放入保湿盒内， 4 冰箱 过夜。 C.4.2 洗涤 孵育结束后，将反应孔中的试剂倒出，用 PBST 洗涤液冲洗 3 次 4 次，每次 15s，然后将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体。 DB21/T 1749.3 2009 8 C.4.3 加入抗原（待测样品） 在酶联板中加入抗原 (待测样品 )，同时加入 阳性指控物和空白对照（即样品提取缓冲液），阳性指控物、空白对照和待测样品每孔内加入 100 L，待测样品重复 3 次，恒温箱中或室温（ 2025 ）孵育2 h。 C.4.4 洗涤 按本规程

22、4.2 执行。 C.4.5 加入酶标抗体 将 CGMMV 的 酶标 抗体按 照试剂盒指定稀释比例用酶标抗体缓冲液稀释，混匀 ，加入 酶联板中 ，混合均匀，于每个反应孔中加入 100L， 放入保湿盒内， 室温（ 2025 ）孵育 2 h。 C.4.6 洗涤 按本规程 4.2 执行。 C.4.7 加入底物试剂 孵育结束前的 15 min 制备 PNP 底物溶液，加入 PNP 显色剂，混合均匀，加入酶联板，每孔 100 L。放入保湿盒内， 室温（ 20 25 ）避光 30 60 min。 C.4.8 终止反应 于每孔中加入 50 L 终止液，终止反应。 C.4.9 测定 用酶标仪在 405 nm 波

23、长下测量结果，读取各孔溶液的光密度值（ OD 值）。 C.5 结果评定 根据试剂 盒提供的方法和标准 。在阳性对照光密度值符合试剂盒设定值的前提下， 以微孔中 阴性 对照的 2 倍为标准，大于这个数值的样品为阳性结果，小于这个数值为阴性结果 。 另外各参照孔（包括底物孔、缓冲液孔、阴性对照、阳性对照）测定值要符合试剂盒设定的目标值；重复样品孔的光密度值一致。 C.6 样品保存 对于检测结果显示为阳性的样品 ，必须对样品进行保存。 种子样品 应保存在 4 冰箱内，叶片和果实样品应保存在 20 冰箱内。 C.7 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括 ：样品的来源、种类、接收时间，实验的时间、地点

24、、方法和结果等，并要有经 手人和实验人员的签字。 DB21/T 1749.3 2009 9 附录 D (规范性附录 ) 黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-PCR 扩增聚合酶链式反应测定 (Polymerase Chain Reaction， PCR)标准 D.1 仪器和用具 D.1.1 仪器设备 PCR仪、电泳仪、 凝胶成像分析仪 、 冷冻离心机、 电子天平 （ 1/10 000g） 、 pH 计、水浴锅、 振荡器等。 D.1.2 用具 可调移液器 （ 0L 20L、 20L 200L、 200L 1000L）及相关吸 头、 eppendorf 管、 研钵、离心管（ 1.5mL、 10mL）、 PCR

25、管（ 0.2 mL）、量筒、烧杯、镊子 等 . D.2 试剂 Trizol为上海生工生物工程有限公司产品 ； RT-PCR试剂盒为 TaKaRa RNA PCR Kit （ AMV） Ver 3.0 （ TaKaRa Code.DRR019A） 。 其他试剂：液氮、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、溴化乙锭。 D.3 检疫程序 D.3.1 器皿前处理 为防止 RNA酶降解 RNA，器皿在 试 验前都要 用 DEPC水 （ V： V=1： 1000） 进行处理。将研钵 、 枪头 、离心管等放于 DEPC水中 37 ，浸泡 24 h，取出后 121 灭菌 30min ，烘干备用。 D.3.2 总 RNA

26、 的提取 取 显症 的叶片液态氮 中充分 研磨， 转入 1.5 mL 的离心管中 ，加入 1 mL Trizol 试剂，室温下静置5 min 后加入 200 L氯仿涡轮震荡 15 s，室温下放置 5 min。 12000 r/min， 4 离心 15 min，转移上清于一个新离心管中，加 600 L异丙醇混匀后于室温下静置 10 min， 12000 r/min， 4 离心 15 min，倒掉上清液，在沉淀物中加 1 mL 75%的乙醇清洗 1次，吸掉上清后室温干燥 3min 5 min，加入 30 L DEPC ddH2O溶解总 RNA。 D.3.3 RT-PCR 反应体系 D.3.3.1

27、引物序列 (CGMMV-西瓜株系 ) 上游引物 （ Primer F） ： 5-ATGGCTTACAATCCGATCAC-3； 下游引物 （ Primer R） ： 5-CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGC-3。 D.3.3.2 RT-PCR 实验步骤 D.3.3.2.1 cDNA 合成 按下列组分制备 RT反应体系 10L， 反应以加入 不含 RNase 的 dH2O为阴性对照 ，反应 条件为 42 1 h； 99 5 min ； 5 5 min扩增 cDNA。 反应体系见 表 D.1。 D.3.3.2.2 PCR 扩增 在冰 浴 上依次将下列组分加入 PCR反应管 中 ， 反应采用

28、50 L 体系 。反应条件为： 94 预变性 3 min；94 变性 30 s， 53 退火 45s， 72 延伸 1 min， 35个循环； 72 延伸 10 min。反应 体系见 表 D.2。 D3.3.2.3 RT-PCR 扩增产物凝胶电泳检测 取 5 L 扩增产物用 6loading buffer 溶解，点样。电泳检测，用溴化乙锭（ EB）溶液进行染色 30 min。在 Image Master 紫外成 相系统（ Pharmacia Biotech）上观察结果并摄像。 DB21/T 1749.3 2009 10 表 D.1 RT 反应体系 表 D.2 PCR 反应体系 D.4 结果评定

29、 观察电泳结果 ， PCR 产物在 500bp处有条带出现，判断样品携带黄瓜绿斑驳花叶病毒，否则为阴性。 D.5 样品保存 对于检测结果显示为阳性的样品，必须对样品进行保存 备查 。 种子样品 应保存在 4冰箱内，叶片和果实样品应保存在 -20冰箱内。 D.6 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、 种类、接收时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。 PCR检测需有电泳结果照片及测序结果。 反应组成 体积（ L） Primer R（ 10M） 0.5 MgCl2 2 10RT Buffer 1 RNase free dH2O 3.75 dNTP Mix

30、ture（ 各 10mM） 1 RNase Inhibitor （ 40 U/L） 0.25 AMV Reverse Transcriptase 0.5 RNA 1 Total 10 反应组成 体积（ L） 5PCR buffer 10 ddH2O 29.25 TaKaRa ETaqHS 0.25 Primer F（ 10M） 0.5 RT 产物（ cDNA） 10 Total 50 DB21/T 1749.3 2009 11 附录 E (规范性附录 ) 黄瓜绿斑驳花叶病毒 快速诊断试纸条或检测盒 测定标准 E.1 检测样品处理 E.1.1 植物样品在检测前需经研磨，并用缓冲液稀释。植物叶片样

31、品可使用配套制样管或制样袋进行样品处理。 E.1.2 将样品叶片（半片至一 片）放入制样管中，充分进行震荡混匀，使样品达到研磨效果，静置待检。 E.1.3 制样袋样品处理：将样品叶片（半片至一片）放入制样袋 中，用研磨棒在制样袋外侧充分研磨。 E.2 样品检测 使用前将试纸条或检测盒恢复至室温（ 15 30）。 E.2.1 试纸条 从包装中取出试纸条，有“箭头”标记端为样品端。样品端垂直向下，插入准备好的样品液中。样品液不要超过胶体金试纸条上的 MAX线。在检测过程中，检测条应一直浸在样品液中，直到检测液爬至检测膜的中部，取出放平，阅读检测结果。 E.2.2 检测盒 从包装中取出诊断盒，将检测

32、盒放平，吸取待测样品 1 2滴滴入加样窗口中，观察检测结果。 测试观察的时间以 10 min 20 min为好。对于病毒浓度低的样 品时间可适当延长。 E.3 结果判定 阳性结果：质控线显粉红色，测试线也显粉红色，检测结果为阳性。 阴性结果：质控线显粉红色，测试线未显色，检测结果为阴性。 无效结果：质控线和测试点线均未显色，说明试纸条失效，检测结果无效。 E.4 注意事项 E.4.1 试纸条和快速诊断盒应在有效期内使用。 E.4.2 试纸条和快速诊断盒应在 2 8冰箱内密封干燥保存。使用时注意未用的要密封。以免吸湿而失效。使用温度应在 15 30。 E.4.3 样品制备对检测结果影响明显。如样品液中有大量组织块，会影响检测条吸取样 品液；如样品液太稀，则易出现假阴性结果。 E.4.4 检测试纸条浸入样品液的深度：浸入深度不能超过“ MAX”标记。如浸入太深，试纸条的一些有效成分会被稀释进入样品液中，而不是进入检测区实现检测反应，出现无效结果。如浸入太浅，则样品液扩散速度降低，甚至无法向上扩散，同样出现无效结果。 E.4.5 检测试纸条不能回收或重复使用。