CNS 8052-2007 Method of test for histamine in foods《食品中组织胺检验法》.pdf

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1、 1 印月 96 1 月 本標準非經本局同意得翻印 中華民國國家標準 CNS 總號 號 ICS 67.020 N61598052經濟部標準檢驗局印 公布日期 修訂公布日期 70 10 月 23 日 96 1 月 19 日 (共 6 頁 )食品中組織胺檢驗法 Method of test for histamine in foods 1. 適用範圍：本標準規定食品中組織胺之檢驗方法。 2. 檢驗方法：組織胺之檢驗可採用高效液相層析法、重氮比色法或螢光法，如其結果發生紛歧時，以高效液相層析法為準。 2.1 高效液相層析法 (high performance liquid chromatograph

2、y, HPLC)。 2.1.1 裝置 2.1.1.1 高效液相層析儀 2.1.1.1.1 偵檢器：具有 254 nm 波長之紫外光偵檢器。 2.1.1.1.2 層析管： ODS， 5 m，內徑 4.6150 mm，或同級品。 2.1.1.2 均質機 (homogenizer)。 2.1.1.3 旋渦混合器 (vortex mixer)。 2.1.1.4 離心機 (centrifuge)：轉速可達 3,000 rpm 以上者。 2.1.1.5 氮氣蒸發裝置 (nitrogen evaporator)。 2.1.1.6 軌跡式振盪器 (orbital shaker)：溫度可達 30 。 2.1.2

3、 試藥：三氯醋酸、氯化鈉、氫氧化鈉、氫氯酸及苯甲醯氯 (benzoyl chloride)皆採用試藥特級；乙醚採用殘量 級；甲醇採用液相層析級；組織胺二鹽酸鹽 (histamine-2 HCl)對照用標準品。 2.1.3 器具及材料 2.1.3.1 塑膠離心管： 50 mL。 2.1.3.2 容量瓶： 50 mL、 100 mL。 2.1.3.3 試管： 20 mL。 2.1.3.4 濾膜：孔徑 0.45 m， polyvinylidene difluoride 材質。 2.1.3.5 濾紙： Whatman No.2，或同級品。 2.1.4 移動相溶液之調製：去離子水與甲醇以 40:60(v

4、/v)之比例混合均勻後，以濾膜過濾，取濾液作為移動相溶液。 2.1.5 衍生化標準溶液之配製 2.1.5.1 標準溶液之配製：精確稱取組織胺二鹽酸鹽 165.6 mg，以 0.1N 氫氯酸溶液溶解並定容至 100 mL，其濃度為 1000 g/mL，供作標準原液。臨用時再以 0.1 N 氫氯酸溶液稀釋成 0.5 100 g/mL，供作標準溶液。 2.1.5.2 衍生化反應：取標準溶液 2 mL 置於試管中，加入 2 N 氫氧化鈉溶液 1 mL 及苯甲醯氯 10 L，以旋渦混合器混合 30 秒，於 30 反應 40 分鐘後，加入飽和食鹽水 2 mL。反應液中加入乙醚 3 mL，以旋渦混合器 2

5、CNS 8052, N 6159 震盪萃取 1 分鐘，靜置分層，收集乙醚層，下層液再加入乙醚 3 mL，同樣操作一次。合併乙醚層，以氮氣吹乾，殘留物以 60%甲醇溶解並定容至 1 mL，供作衍生化標準溶液。 2.1.6 檢液之調製 2.1.6.1 萃取：檢體細切，以均質機均質後，取魚肉 5 g，精確稱定，置於塑膠離心管中 ,加入 6%三氯醋酸溶液 20 mL，均質 3 分鐘，再以 3,000 rpm離心 5 分鐘，上澄液以濾紙過濾。離心管中之沈澱物再加入 6%三氯醋酸溶液 20 mL，同樣操作一次。合併上澄液，以 6%三氯醋酸溶液定容至 50 mL，供衍生化用。 2.1.6.2 衍生化反應：取

6、 2.1.6.1 節供衍生化反應之溶液 2 mL 置入試管中，加2 N 氫氧化鈉溶液 1 mL 及苯甲醯氯 10 L，以下依第 2.1.5.2 節進行衍生化反應，再以 60%甲醇溶解並定容至 1 mL，供作檢液。 2.1.7 鑑別試驗及含量測定：精確量取檢液及衍生化標準溶液各 20 L，分別注入高效液相層析儀中，參照下列條 件進行液相層析，就檢液與衍生化標準溶液所得波峰之滯留時間比較鑑別 之，並另以標準曲線求出檢體中組織胺之含量 (mg/100 g)。 檢體中組織胺含量 (mg/100 g)=CV0.1/M C：由標準曲線求得檢液中組織胺之濃度 (g/mL) V：檢體衍生化前定容之體積 (mL

7、) M：取樣分析檢體之重量 (g) 高效液相層析儀測定參考條件 層析管柱： ODS， 5 m，內徑 4.6150 mm 紫外光偵檢器：波長 254 nm 移動相溶液：依第 2.1.4 節所調製之溶液 移動相流速： 1.0 mL/min 備考：本檢驗方法之最低檢出限量為 0.1 mg/100 g。 2.2 重氮比色法 (diazo colorimetric method)：呈色法測定組織胺可能高估，許多生物胺都有類似之呈色反應。 2.2.1 裝置 2.2.1.1 分光光度計 (spectrophotometer) 2.2.1.2 均質機 (homogenizer) 2.2.2 試藥；冰醋酸、氫氯

8、酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、亞硝酸鈉、胺基磺酸 (sulfanilic acid)、三氯醋酸及丙酮皆採用試藥特級；離子交換樹脂採用 Amberlite CG-50, (Type 1), 100 200 mesh 或同級品；組織胺二鹽酸鹽 (histamine-2 HCl) 對照用標準品。 2.2.3 器具及材料 2.2.3.1 離子交換樹脂管柱：玻璃管柱，規格如圖 1 所示。 2.2.3.2 容量瓶： 10 mL、 50 mL、 100 mL、 1000 mL。 3 CNS 8052, N 6159 圖 1 離子交換樹脂管柱 單位： mm 2.2.3.3 三角瓶： 50 mL。 2.2.3.4 燒杯

9、： 50 mL。 2.2.3.5 試管：內徑 18 mm，長約 180 mm。 2.2.3.6 濾紙： Whatman No.2，或同級品。 2.2.4 離子交換樹脂之製備： 2.2.4.1 離子交換樹脂之處理：取離子交換樹脂加 5 倍量之 1 N 氫氯酸溶液，均勻攪拌 10 20 分鐘，靜置後棄上澄液，重覆操作 3 次，再以 5 倍量蒸餾水重覆洗至上澄液呈中性為止。再以 5 倍量之 0.2 N 醋酸緩衝溶液攪拌 5 10 分鐘，靜置後棄上澄液，重覆操作至上澄液之 pH 為 4.6後，移至共栓瓶中。經緩衝化之離子交 換樹脂可長期保存於冰箱，但若發霉，則不可使用。 2.2.4.2 離子交換樹脂管

10、柱之充填：於管柱底部 舖玻璃棉或玻璃纖維，填加樹脂至 5.5 cm 高。以 0.2 N 醋酸緩衝溶液充填管柱，將空氣除去後，樹脂上端再舖少許玻璃棉或玻璃纖維，再通過 0.2 N 醋酸緩衝溶液平衡之，玻璃 管柱下端接橡皮管，調整流速為 2 3 mL/min，直至樹脂上端 0.2 N 醋酸緩衝溶液將流盡為止，備用。 2.2.4.3 用過樹脂之再生：用過之樹脂先以 5 倍量丙酮攪拌，脫脂，以 2 N 氫氯酸溶液處理，並充分水洗後，再以 0.2 N 醋酸緩衝溶液依第 2.4.1 節離子交換樹脂玻璃棉8 mm30 mm90 mm 70 mm 55 mm 4 CNS 8052, N 6159 同樣操作。

11、2.2.5 試劑之調製 2.2.5.1 2 N 醋酸緩衝溶液：稱取冰醋酸 120 g 加氫氧化鈉 40 g，加蒸餾水溶解並定容至 1000 mL，此溶液之 pH 大約 4.6，必要時以醋酸鈉調整 pH為 4.6。 2.2.5.2 0.4 N 醋酸緩衝溶液：取 2 N 醋酸緩衝溶液以蒸餾水稀釋 5 倍。 2.2.5.3 0.2 N 醋酸緩衝溶液：取 2 N 醋酸緩衝溶液以蒸餾水稀釋 10 倍。 2.2.5.4 1 N 氫氯酸溶液：取氫氯酸 83.3 mL，加入蒸餾水使成 1000 mL。 2.2.5.5 0.2 N 氫氯酸溶液：取 1 N 氫氯酸溶液以蒸餾水稀釋 5 倍。 2.2.5.6 10%

12、氫氯酸溶液：取氫氯酸 27.0 mL 加蒸餾水使成 100 mL。 2.2.5.7 1.5 N 碳酸鈉溶液：稱取碳酸鈉 39.75 g 溶於蒸餾水，再加蒸餾水使成500 mL。 2.2.5.8 1.1 N 碳酸鈉溶液：稱取碳酸鈉 29.15 g 溶於蒸餾水，再加蒸餾水使成500 mL。 2.2.5.9 胺基磺酸溶液：稱取胺基磺酸 0.9 g 溶於 10%氫氯酸溶液，再加 10%氫氯酸溶液使成 100 mL。 2.2.5.10 重氮試液：胺基磺酸溶液與 5%亞硝酸鈉溶液以 1： 1 (v/v)之比例，於冰浴中混合，冷卻 20 30 分鐘後使用，臨用時調製。 2.2.6 標準溶液之配製：精確稱取組

13、織胺二鹽酸鹽 165.6 mg，以蒸餾水溶解並定容至 100 mL，濃度為 1000 g/mL，供作標準原液，於冰箱保存。標準原液以 5%三氯醋酸溶液稀釋成 5、 10 及 15 g/mL，供作標準溶液。 2.2.7 檢液之調製 2.2.7.1 萃取：取切碎之魚肉檢體約 10 g，精確稱定，置於均質機中，加入蒸餾水 20 mL，均質 3 分鐘，再加入 10%三氯醋酸溶液 20 mL，混合均勻，放置 10 分鐘。以濾紙過濾，取濾液以蒸餾水定容至 50 mL，供淨化用。 2.2.7.2 淨化：取第 2.2.7.1 節供淨化用之溶液 10 mL，置於燒杯中，以 10%氫氧化鈉溶液調整 pH 至 4.

14、5 4.7(以 BCG 試紙測試 )，再加 0.4 N 醋酸緩衝溶液 10 mL，混合均勻，注入離子交換樹脂管柱，調整流速為 2 3 mL/min。先以 0.2 N 醋酸緩衝溶液 80 mL 沖洗離子交換樹脂管柱，棄流出液。再以 0.2 N 氫氯酸溶液 8 mL 沖提組織胺，沖提液以 1.5 N 碳酸鈉溶液調整 pH 為 7(以 BCG 試紙測試 )，再以蒸餾水定容至 10 mL，供作檢液。 2.2.7.3 重氮呈色反應：取 1.1 N 碳酸鈉溶液 5 mL 置於試管中，加入重氮試液2 mL， 1 分鐘後加入檢液 2 mL，激烈振盪，準確地 5 分鐘後，於 510 nm測定吸光值。另以 0.2

15、 N 氫氯酸溶液代替檢液，通過離子交換樹脂管柱，並調整 pH 為 7，再依照上述重氮呈色反應同樣操作，進行空白試驗。 5 CNS 8052, N 6159 2.2.8 標準曲線之製作：分別取標準溶液各 10 mL，置於燒杯中，以 10%氫氧化鈉溶液調整 pH 為 4.6，再加 0.4 N 醋酸緩衝溶液 10 mL，以下依照第 2.2.7.2節同樣操作。經過離子交換樹脂管柱之標準溶液再依照第 2.2.7.3 節進行重氮呈色反應 。經空白試驗校正之吸光值與對應之組織胺含量 (g/mL)，製作標準曲線。 2.2.9 含量測定：檢液之吸光值，經空 白試驗校正後，依下列計算式求出檢體中組織胺之含量 (m

16、g/100 g)。 魚肉中組織胺之含量 (mg/100 g) CV0.1/M C：由標準曲線求得檢液中組織胺之含量 (g/mL) V：檢體淨化前定容之體積 (mL) M：取樣分析檢體之重量 (g) 2.3 螢光法 (fluorometric method) 2.3.1 裝置與儀器 2.3.1.1 螢光光度計：汞燈，激發波長 350 nm，放射波長 444 nm。 2.3.1.2 均質機 (homogenizer)。 2.3.2 試 藥：氫 氯 酸、磷 酸 (85%)、氫氧化鈉、甲醇 o-phthalicdicarboxaldehyde (OPT)採用試藥特級；離子交換樹脂採用 Bio-Rad

17、AG1-X8, 50 100 mesh 或 Dowex 18, 50 100 mesh，或同級品；組織胺二鹽酸鹽 (histamine-2 HCl)對照用標準品。 2.3.3 器具及材料 2.3.3.1 離子交換樹脂管柱：內徑 7 mm，長 200 mm 之聚丙烯管柱。接長約 45 cm 之鐵弗龍 (teflon)管，控制流速大於 3 mL/min。 2.3.3.2 容量瓶： 50 mL、 100 mL、 1000 mL。 2.3.3.3 三角瓶： 50 mL。 2.3.3.4 濾紙： Whatman No.2，或同級品。 2.3.4 離子交換樹脂管柱之製備 2.3.4.1 離子交換樹脂之處理

18、：每 g 離子交換樹脂以 2 N 氫氧化鈉溶液 15 mL攪拌，靜置小於 30 分鐘，棄氫氧化鈉溶液，再加 2 N 氫氧化鈉溶液15 mL，同樣操作。以蒸餾水洗去多餘的鹼， 將樹脂保存於蒸餾水中，每星期處理一次。 2.3.4.2 離子交換樹脂管柱之充填：於管柱底部舖玻璃棉，填 加樹脂至 8 cm高，以蒸餾水充填管柱至樹脂上部。注入檢液前，以蒸餾水 10 mL 清洗管柱。 備考：不要在管柱中處理樹脂之再生，必要時，以燒杯處理之。 2.3.5 試劑之調製 2.3.5.1 3.57 N 磷酸溶液：取磷酸 121.8 mL，以蒸餾水稀釋至 1000 mL。 2.3.5.2 OPT 溶液：稱取 OPT

19、100 mg，以甲醇溶解並定容至 100 mL，儲存於褐色瓶中，於冰箱保存，每星期配製一次。 6 CNS 8052, N 6159 2.3.6 標準溶液之配製：精確稱取組織胺二鹽酸鹽 165.6 mg，以 0.1 N 氫氯酸溶液溶解並定容至 100 mL，濃度為 1000 g/mL (以游離組織胺計算 )，作為標準原液，每星期配製一次。取標準原液 1 mL，以 0.1 N 氫氯酸溶液稀釋至 100 mL，濃度為 10 g/mL，此為中間液，每星期配製一次。分別量取中間液 1, 2 及 3 mL，以 0.1 N 氫氯酸溶液稀釋至 100 mL，濃度分別為 0.1, 0.2 及 0.3 g/mL，

20、供作標準溶液，臨用時配製。 2.3.7 標準曲線之製作：量取 3 種不同濃度之標準溶液各 5 mL (二重覆 )，分別置於三角瓶中，加入 0.1 N 氫氯酸溶液 10 mL，混合均勻，再加入 1 N 氫氧化鈉溶液 3 mL，混合均勻， 5 分鐘內加入 OPT 溶液 1 mL，立刻混合均勻，準確地 4 分鐘後，再加入 3.57 N 磷酸溶液 3 mL，立刻混合均勻。另以 0.1 N氫氯酸溶液 5 mL 代替組織胺標準溶液，依照上述同樣操作，當作空白試驗。於 1.5 小時內，以激發波長 350 nm 及放射波長 444 nm 測定每一標準溶液之螢光，以經過空白試驗校正過之 螢光讀數與對應之標準溶液

21、中組織胺含量(g/mL)，製作標準曲線。 2.3.8 檢液之調製 2.3.8.1 萃取：取切碎之檢體 10 g，精確稱定，加入甲醇 50 mL，以均質機均質 2 分鐘，均質液移入容量瓶中，以甲醇清洗均質機，清洗液一併倒入容量瓶中，於 60 水浴中加熱 15 分鐘，冷 却 至 25 ，再以甲醇定容至 100 mL，混合均勻，以濾紙過濾，濾液可貯藏於冰箱中數週。 2.3.8.2 淨化：取第 2.3.8.1 節之濾液 1 mL 注入離子交換樹脂管柱中，加入蒸餾水 4 5 mL，立刻以盛有 1.0 N 氫氯酸溶液 5 mL 之容量瓶接收流出液。當管柱中溶液流至樹脂上方 2 mm 處時，立刻加入蒸餾水

22、5 mL，重覆加蒸餾水之步驟，直至大約 35 mL 蒸餾水通過管柱後，再以蒸餾水定容至 50 mL，混合均勻，供作檢液，保存於冰箱。 2.3.9 含量測定：取檢液 5 ml 置於三角瓶中，加 0.1 N 氫氯酸溶液 10 mL，以下依照第 2.3.7 節同樣操作，測定檢液之螢光讀數。並依下列計算式求出檢體中組織胺之含量 (mg/100 g)。 魚肉中組織胺之含量 (mg/100 g) CV10/M C：由標準曲線求得檢液中組織胺之含量 (g/mL) V：檢體經淨化後定容之體積 (mL) M：取樣分析檢體之重量 (g) 備考 1. 操作前以氫氯酸：蒸餾水 (1： 3)潤濕所有塑膠及玻璃容器。 2.標準曲線依螢光計種類不同有所變異。 相對應國際標準： AOAC Official Method 977.13 Histamine in Seafood Fluorometric Method