CNS 10463-2005 Method of test for Penicillin in feeds《饲料中青霉素之检验方法》.pdf

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1、 1 印行年月 94 年 10 月 本標準非經本局同意不得翻印 中華民國國家標準 CNS 總號 類號 ICS 65.100.1 N410910463經濟部標準檢驗局印行 公布日期 修訂公布日期 72 年 7 月 11 日 94 年 1 月 10 日 (共 4 頁 )飼料中青黴素之檢驗方法 Method of test for Penicillin in feeds 1. 適用範圍：本標準規定飼料中青黴素（ Penicillin；配尼西林）之檢驗方法。 2. 原理：飼料中青黴素，以 pH6.0 之 1 %磷酸緩衝溶液萃取後，使用生物分析法測定。 3. 檢驗方法 3.1 工作環境：工作平檯須寬敞、

2、潔淨，光線良好操作平檯光度為 100 呎燭光(cd;candela），密閉室內換氣 良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。微生物密度之要求為每 15 分鐘落菌數不得超過 15 CFU /培養皿。 3.2 設備 3.2.1 裝置 3.2.1.1 轉速可至 4,000 rpm 之離心機 (Centrifuge)與容量為 50 mL 玻璃或塑膠製品之離心管（ Centrifuge tube） 3.2.1.2 離心管振盪器（ Shaker） 3.2.1.3 酸鹼值測定儀 (pH meter) 3.2.1.4 50 恆溫水浴槽 3.2.1.5 冰箱：能維持 41 者。 3.2.1.6 培養箱：能維持內部溫差在

3、 1 以內者。 3.2.1.7 微量吸管（ Micropipette）： 20 L、 100 L、 200 L 及 1000 L。 3.2.1.8 吸管：已滅菌， 1 mL 者應有 0.01 mL 之刻度； 5 及 10 mL 者應有 0.1 mL之刻度。 3.2.1.9 培養皿：已滅菌，內徑約 90 mm，高約 20 mm，底皿內外平坦、無氣泡、刮傷或其他缺點者。 3.2.1.10 乾熱滅菌器（ Oven）：內部中心溫度能達 170 以上者。 3.2.1.11 高壓滅菌釜（ Autoclave）：能適用 121 （約 15 lb/in2或 1 kg/cm2）滅菌 15 分鐘以上者。 3.2.

4、1.12 不銹鋼圓筒（ Stainless cylinder）：外徑 80.1 mm，內徑 60.1 mm，高 100.1 mm。 3.2.1.13 抗生素抑菌圈測讀計（ Antibiotic zone reader）：可供量取抑菌圈之直徑者。若無本器，可使用游標尺或其他量尺。 3.2.2 材料：試驗菌為 Staphylococcus luteus ATCC 9341a。 3.3 試藥：鹽酸、氫氧化鈉、無水磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鉀、青黴素酶、青黴素 G 鈉鹽（ Penicillin G）對照標準品。 3.4 緩衝溶液之製備 2 CNS 10463, N 4109 pH6.0 之 1 % 磷酸

5、緩衝溶液： 8.0 g KH2PO4 2.0 g K2HPO4溶解於 900 mL 蒸餾水中，以 HCl 調至 pH6.00.1，然後稀釋至 1L。 3.5 培養皿 3.5.1 抗生素培養皿 1 號（ Antibiotic Medium 1） 蛋白腖 (Peptone) 6.0 g胰消化酪蛋白（ Pancreatic digest of casein） 4.0 g 酵母萃取物（ Yeast extract） 3.0 g牛肉萃取物（ Beef extract） 1.5 g 葡萄糖（ Dextrose） 1.0 g洋菜（ Agar） 15.0 g蒸餾水 加至 1000 mL 加熱溶解後，以 121

6、 滅菌 15 分鐘後，作成斜面培養皿，最終 pH 值為6.50.1。 3.5.2 抗生素培養皿 4 號（ Antibiotic Medium 4） 蛋白腖（ Peptone） 6.0 g 酵母萃取物（ Yeast extract） 3.0 g牛肉萃取物（ Beef extract） 1.5 g 葡萄糖（ Dextrose） 1.0 g洋菜（ Agar） 15.0 g蒸餾水 加至 1000 mL 加熱溶解後，以 121 滅菌 15 分鐘，最終 pH 值為 6.50.1。滅菌後待冷卻至約 48 ，加入試驗菌液，均勻混合，培養皿每只分裝 10 mL，於平坦檯面自然凝固備用。 3.6 試驗菌液之製備

7、試驗菌以抗生素培養皿 4 號於 30 培養 171 小時。使用時，調其菌液濃度使添加於種層培養皿後，於高倍稀釋之標準溶液（ 0.0125 g/mL）呈現直徑約10 mm 之抑菌圈，於低倍稀釋之標準溶液（ 0.2 g/mL）呈現直徑約 25 30 mm之抑菌圈（試驗菌液於冰箱中保存不可超過 2 週）。 3.7 培養皿 加適量之試驗菌液於剛融解並冷卻至約 48 之抗生素培養皿 1 號，然後取 10 mL 於培養皿，以傾斜圓轉之動作搖動培養皿使其分布均勻，待其自然凝固。培養皿需在製備當日使用。 3.8 標準溶液 3.8.1 原液：正確秤量標準青黴素 G 鈉鹽，以 pH6.0 之 1 % 磷酸緩衝溶液

8、溶解定容，使其濃度為 600 g/mL。儲存於 2 10 ， 4 週內有效。 3.8.2 標準曲線：以 pH6.0 之 1 % 磷酸緩衝溶液將原液稀釋，使其濃度為 0.0125、0.025、 0.05、 0.1 及 0.2 g/mL 之標準溶液。 3.9 標準曲線之製作 3 CNS 10463, N 4109 3.9.1 以滅菌過之鑷子夾取經滅菌之不銹鋼圓筒投放於定量用培養皿上，按 60 度圓心角放置六枚。 3.9.2 每一濃度之青黴素標準溶液，使用 3 個定量用培養皿，四種不同濃度（參比濃度除外）共需 12 個定量用培養皿。 3.9.3 於每個培養皿上放置之 6 個圓筒相間之 3 個圓筒內注

9、入標準溶液，其餘 3個圓筒注入參比濃度標準溶液，注入量為 320 L 或適當定量。 3.9.4 於 301 培養 171 小時後，以抗生素抑菌圈測讀計或游標卡尺測量其抑菌圈直徑。 3.9.5 量取同一濃度標準溶液之 9 個抑菌圈直徑及 9 個參比濃度之抑菌圈直徑，分別計算其平均值。 3.9.6 求取參比濃度 36 個抑菌圈平均 值，以此做為該抗生素標準曲線之修正點(Correction point)。 3.9.7 以修正點和該抗生素參比濃度 抑菌圈直徑平均值之差，調整各標準溶液抑菌圈平均值，每一標準溶液因 此可得一修正抑菌圈直徑平均值（如當修正點為 20.0 mm，參比濃度抑菌圈平均值為 19

10、.8 mm，二者之差為 0.2 mm，標準溶液抑菌圈直徑平均值若為 17.0 mm，則修正為 17.2 mm）。 3.9.8 在半對數函數表上，以四種濃 度之標準溶液修正抑菌圈直徑平均值及修正點為橫軸（自然數值），濃度為縱軸（對數值），繪出標準曲線。 3.9.9 該標準曲線最低濃度抑菌圈直徑平均值 (L)及最高濃度 抑菌圈直徑平均值(H)可由下列公式計算出。 L (3a 2b c e)/5 H (3e 2d c a)/5 a,b,d,e 為低至高濃度標準溶液之修正抑菌圈直徑平均值， c 為 36 個參比濃度抑菌圈之平均值 (修正點 )。 3.10 檢液之製備 3.10.1 秤取 5.0 g 樣

11、品，置入離心管內。 3.10.2 加入 20 mL pH6.0 之 1 %磷酸緩衝溶液振盪 20 分鐘。 3.10.3 以 2,500 3,000 rpm 離心 15 分鐘，取上層液（檢液）點圓筒。 3.11 圓筒平板法（ Cylinder plate method） 3.11.1 將經滅菌之不銹鋼圓筒投放於含試驗菌之培養皿上，按 60圓心角放置 6個圓筒。 3.11.2 取上述培養皿 3 個，使用微量吸管定量吸取樣品檢液 320 L，分別注入於每個培養皿上之 3 個間隔圓筒內。 3.11.3 另外 3 個圓筒內則分別注入青黴素參比濃度標準溶液各 320 L。 3.11.4 於 301 恆溫箱

12、中培養 171 小時後，以抗生素抑菌圈測讀計或游標卡尺，測定樣品檢液（共 9 個值）及抗生素參比濃度（每種 3 個值）之圓筒抑菌圈平均值，並將結果記錄。 3.11.5 若檢液無明顯抑菌圈（直徑小於 12 mm）時，則表示該樣品無青黴素之殘 4 CNS 10463, N 4109 留；有明顯抑菌圈 (直徑 12 mm 以上 )時，則繼續進行下述之操作。 3.12 鑑定 3.12.1 加足量之配尼西林分解酶（ Penicillinase）於測定液中，將此混合液在 37 作用 1 小時。 3.12.2 重複圓筒平板法之試驗，若抑菌圈有明顯變 小或變無時，則表示有青黴素（抗青黴素酶者除外）之殘留。 3

13、.13 回收率試驗：分別添加 100 g/mL 青黴素標準溶液 50 L 於檢體 5 g 中，使添加濃度為 1 g/g，作三重複試驗。依第 3.10 節製備檢液，再以第 3.11 節分別測量其抑菌圈直徑。並以下列公式計算，求得檢體之回收率。 各添加濃度之檢體回收率（ %） A/B100 % A：各添加濃度之檢液所產生之抑菌圈直徑平均值 B：各添加濃度之標準溶液所產生之抑菌圈直徑平均值 檢體平均回收率為添加濃度檢體回收率之平均值。 3.14 青黴素殘留量之計算：以青黴素標 準曲線之參比濃度修正點和參比濃度抑菌圈直徑平均值之差，修正青黴素參 比濃度之抑菌圈平均值並計算出該樣品抑菌圈修正值，再依下列公式計算，以求得該樣品之抗生素實際殘留量。 檢體中青黴素殘留量（ ppm） SR S：標準曲線上求得之檢體殘留青黴素濃度（ ppm）。 R：該類空白檢體添加青黴素試驗平均回收率（ %）。 備考：本檢驗方法之最低檢出限量為 2 ppm。