DB13 T 2593-2017 禽腺病毒4型PCR检测方法.pdf

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1、ICS 11.220 B 43 DB13 河北省 地方标准 DB13/T 2593 2017 禽腺病毒 4 型 PCR 检测方法 2017 - 11 - 22 发布 2017 - 12 - 22 实施 河北省质量技术监督局 发布 DB13/T 2593 2017 I 前 言 本 标准按照 GB/T 1.1-2009给出 的规则 起草 。 本标准由河北农业大学提出。 本标准起草单位：河北农业大学。 本标准主要起草人： 袁万哲、王建昌、孙继国、刘聚祥、李丽敏、陈立功、李睿文、张磊、白云 、陈赛娟、李杰峰 。 DB13/T 2593 2017 1 禽腺病毒 4 型 PCR 检测方法 1 范围 本标准

2、规定了禽腺病毒 4型 PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于检测家禽咽 喉拭子、肛拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽腺病毒 4型。 2 术语和定义 下列 术语和定义 适用于本文件。 2.1 DNA 脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid） 2.2 EB 溴化乙锭（ ethidium bromide） 2.3 PCR 聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction） 2.4 dNTP 脱氧核苷酸三磷酸（ deoxy-ribonucleoside triphosphate） 3 试剂或 材料 包括 各种市售病毒核酸提取试剂盒， 1.0 %琼脂糖凝

3、胶， 50 TAE缓冲液，溴化乙锭（ EB， 10 ug/L）或核酸染料，焦碳酸二乙酯（ DEPC）处理的灭菌的双蒸水， DNA分子量标准（ 100 bp）， 2Taq MasterMix或商品化的一步法 PCR反应试剂。 警示 :电泳中用到的 EB在操作中应戴手套和口罩。试验中被 EB污染的物品要进行无害化处理； DEPC在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。 3.1 病毒核酸 提取试剂盒。 3.2 1.0 %琼脂糖凝胶，配制 方法 见附录 A 中 A.1。 3.3 50 TAE 缓冲液，配制 方法 见附录 A 中 A.2。 3.4 溴化乙锭（ EB， 1

4、0 ug/ L）或核酸染料，配制 方法 见附录 A 中 A.3。 3.5 焦碳酸二乙酯（ DEPC）处理的灭菌的双蒸水，配制 方法 见附录 A 中 A.4。 DB13/T 2593 2017 2 3.6 DNA 分子量标准（ 100 bp） :包含 100 bp、 250 bp、 500 bp、 750 bp、 1000 bp、 2000bp 几种分子量标准。 3.7 2Taq MasterMix 。 3.8 商品化的一步法 PCR 反应试剂 ： 含有 PCR 缓冲液、酶混合物、 dNTP 混合物、无 RNA 酶的水等。 3.9 引物 ： 上游引物与下游引物见附录 B 中 的表 B.1。引物浓

5、度为 10 mol/L。 4 仪器设备 4.1 PCR 仪 ： 温度范围 4.0 99.9；样品基座配置至少包括单个 0.2 mL 孔。 4.2 凝胶成像系统 ： 检测灵敏度 DNA 0.1 ng；有效像数 1360 1024、 10bit、 USB 2.0。 4.3 台 式低温高速离心机 ： 最高转速 16000 r/min； 容量 1.5 mL 12。 4.4 电泳仪 ： 电压 50 V 120 V，电流 10 mA 800 mA，定时 0min 999min。 4.5 电泳槽 :耐高温、耐腐蚀、不漏液；缓冲液容量充足。 4.6 冰箱 :具有冷藏功能。 4.7 微量移液器 :单道可调；量程

6、包括 0.5 10 L、 2 20 L、 10 100 L、 100 1000 L。 4.8 水浴锅 :温度范围 为 室温 100。 5 样品 5.1 阴阳性对照 以灭活的禽腺病毒 4型 鸡胚尿囊液 作为阳性对照，以正常 鸡胚尿囊液 或者是正常家禽组织作为阴性对照。对照均应 在 -20保存。 5.2 样品的采集与处理 5.2.1 采集工具 下列的采集工具应经 121 2， 20 min高压灭菌并烘干： a) 棉拭子； b) 剪刀； c) 镊子； d) 1.5 mL 离心管； e) 研钵。 5.2.2 棉拭子采集 将棉拭子深入咽喉或肛门转一圈；将采集后的棉拭子放入盛有 1.0 mL PBS（配制

7、 方法 见附录 A中 A.5）的 1.5 mL的离心管，加盖，编号。 5.2.3 组织采集 DB13/T 2593 2017 3 剖检家禽，用剪刀采集心肝脾肺肾法氏囊等组织，装入一次性灭菌容器，编号。 5.2.4 样品储运 样品采集后放入塑料 袋 内 密封 （一个采集点的样品放一个塑料 袋 内），于保温箱中加冰，密封 24 h内送至实验室 。 5.2.5 样品的处理 5.2.5.1 棉拭子处理方法 将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出， 4条件下 3000 r/min离心 15 min，取上清液转入无菌的 1.5 mL离心管中，编号备用。 5.2.5.2

8、 组织的处理方法 将所采集的组织 置 于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比（ 1:5）加入样品保存液进行充分研磨， 4条件下 3000 r/min离心 15 min。取上清转入无菌的 1.5 mL的离心管备用，编号。 6 操作步骤 6.1 DNA 的提取 用病毒核酸提取试剂盒，按照如下步骤提取待检样品、阳性对照及阴性对照样品的 DNA。 6.1.1 加入 20 L 蛋白酶 K 于 1.5 mL 离心管中，在离心管中加入 200 L 样品，加入 200 L BB5，涡旋混合 15 s， 56孵育 15 min。 6.1.2 加入 250 L 无水乙醇，涡旋混合 15 s，室温放置

9、 5 min。 6.1.3 将溶液和沉淀一起加入离心柱中， 12000 r/min 离心 1 min，弃掉流出液。 6.1.4 加入 500 L WB5,12000 r/min 离心 1 min，弃掉流出液，重复一次。 6.1.5 室温 12000 r/min 离心 1min，彻 底去除残留的乙醇，在室温静置 1 min 3 min 彻底晾干离心柱。 6.1.6 将离心柱转入 1.5 mL 离心管中，并向离心柱中央加 20 L RNase-free Water，室温静置 1min。 6.1.7 室温 12000 r/min 离心 1min，洗脱 DNA， -20贮存备用。 6.2 PCR 在反

10、应管中依次加入 8 L无核酸酶水、 10 L 2Taq MasterMix、 1 L上述 DNA溶液、 0.5 L 10 mol/L的上游引物、 0.5 L 10 mol/L的下游引物，最终至总体积为 20 L。经充分混匀后瞬时离心 ，使液体全部聚集于管底。 PCR扩增条件： 94预变性 3 min， 94变性 10 s， 56退火 30 s， 72延伸 57 s，循环 30次； 72延伸 5 min。扩增反应结束后立即进行电泳或置 于 4 条件下 备用。 7 试验数据处理 DB13/T 2593 2017 4 7.1 扩增产物的电泳检测 制备 1.0 %琼脂糖凝胶板。在电泳槽内加入 1 TA

11、E电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取 3 L 5 L扩增产物加到 凝胶孔，加入 DNA分子量标准 （ 100 bp） 。恒压（ 110V）电泳 30 min 40 min，将 电泳 好的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。 7.2 结果判定 阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性的条带 ； 阴性的扩增产物没有预期的目的条带 ； 阴阳性同时成立表明 试 验有效，否则 试 验无效。在试验结果成立的前提下，如果样品的 PCR产物电泳后在 954 bp位置出现特异性的条带，则判定为禽腺病毒 4型核酸检测阳性；如果样品的 PCR产物电泳后在 954 bp位置未出现特异性的条带，则判定

12、为禽腺病毒 4型核酸检测阴性。 PCR产物电泳图见附录 C中 C.1。 8 试验报告 依次陈述试验对象、所使用的标准（包括发布或出版年号）、所使用的方法、检测结果、与试验时间等。 DB13/T 2593 2017 5 附 录 A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 1.0 %琼脂糖凝胶 称取琼脂糖 1.0 g，放入 100 mL 1 TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至 60时，加入 5 L核酸染料，均匀铺板，厚度为 3 mm 5 mm。 A.2 50 TAE 电泳缓冲液 A.2.1 0.5 mol/L EDTA 溶液（ pH 8.0） 称取 EDTA 18.61 g，加灭菌双蒸 水至

13、100 mL，后用氢氧化钠调 pH至 8.0。 A.2.2 TAE 电泳缓冲液（ 50） Tris 242 g，冰乙酸 57.1 mL， 0.5 mol/L EDTA 100 mL，加灭菌双蒸水至 1000 mL。 A.3 溴化乙锭（ EB）溶液 溴化乙锭 20 mg，加灭菌双蒸水至 20 mL。 A.4 DEPC 水 焦碳酸二乙酯（ DEPC） 50 L，加灭菌双蒸水至 100 mL，室温放置 6 h 8 h， 121 2高压灭菌 20 min，分装到 1.5 mL DEPC处理过的离心管。 A.5 PBS 缓冲液 A.5.1 A 液（ 0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液）： NaH2PO

14、4 H2O 27.6 g 先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至 1000 mL。 A.5.2 B 液（ 0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液）： Na2HPO4 7H2O 53.6 g，（或 Na2HPO4 127H2O 71.6 g或 Na2HPO4 2H2O 35.6 g）先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至 1000 mL。 A.5.3 0.01 mol/L pH 7.2 磷酸盐缓冲液的配制： A 液 14 mL， B 液 36 mL，加氯化钠（ NaCl） 8.5 g，最后用蒸馏水稀释至 1000 mL。 DB13/T 2593 2017 6 附 录 B （规范性附录） 引 物 表 B.1规定 了上游引物和下游引物的浓度和序列。 表 B.1 上游引物和下游引物的浓度和序列 引物名称 引物浓度 序列（ 5- 3） 上游引物 10 mol/L CCG ACC GTT ACA AGT TTA GCA T 上游引物 10 mol/L TTC GCA GGA AGT CGT AGT GGA DB13/T 2593 2017 7 附 录 C （规范性附录） 禽腺病毒 4 型 PCR 产物电泳图 说明： M DNA分子量标准（ 100 bp）； 1 阳性对照； 2 阴性对照。 图 C.1 禽腺病毒 4 型 PCR 产物电泳图 _