GBZ T 240.11-2011 化学品毒理学评价程序和试验方法 第11部分：体外哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验.pdf

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1、ICS 13.100 C 52 EHZ 中华人民共和国国家职业卫生标准GBZ/T 240. 11一2011化学晶毒理学评价程序和试验方法第11部分:体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals一Part 11 : In vivo mammalian erythrocyte micronucleus test 2011-08-19发布2012-03-01实施中华人民共和国卫生部发布数码防伪中华人民共和国国家职业卫生标准化学晶毒理学评价程序和试验方法第11部分:体内哺乳动物骨髓晤多

2、染红细胞微核试验GBZ/T 240. 11-2011 争6中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 开本880X 1230 1/16 印张0.5字数9千字2011年10月第一版2011年10月第一次印刷* 书号:155066. 2-22224定价14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533目。昌根据中华人民共和国职业病防治法制定本部分。GBZ/T 240(化学品毒理学评价程序和试验方法现分为以下四十四部分:一一第1部分:总则

3、;一一第2部分:急性经口毒性试验;一一第3部分:急性经皮毒性试验;一一第4部分:急性吸入毒性试验;一一第5部分:急性眼剌激4性/腐蚀性试验;一一第6部分:急性皮肤刺激性/腐蚀性试验;第7部分:皮肤致敏试验;一一第8部分:鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验;一一第9部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验;第10部分z体外哺乳动物细胞基因突变试验;第11部分:体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验;一一第12部分:体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验;一一第13部分:哺乳动物精原细胞/初级精母细胞染色体畸变试验;一一第14部分:啃齿类动物显性致死试验;第15部分:亚急性经口毒性试验;一一第16部分:亚急性经皮毒

4、性试验;第17部分:亚急性吸人毒性试验;一一一第18部分z亚慢性经口毒性试验;一一第19部分:亚匮性经皮毒性试验;一一第20部分:亚慢性吸人毒性试验;一一第21部分:致畸试验;一一第22部分:两代繁殖毒性试验;一一第23部分:迟发性神经毒性试验;第24部分:慢性经口毒性试验;一一第25部分:慢性经皮毒性试验;一一第26部分:慢性吸人毒性试验;一一第27部分:致癌试验;一-第28部分:慢性毒性/致癌性联合试验;一一第29部分:毒物代谢动力学试验;一一第30部分:皮肤变态反应试验-局部淋巴结法;一一第31部分:大肠杆菌回复突变试验;一一第32部分t酵母菌基因突变试验;一一第33部分:果蝇伴性隐性致

5、死试验;一一第34部分:枯草杆菌基因重组试验F一一第35部分:体外哺乳动物细胞程序外DNA合成(UDS)试验;第36部分:体内哺乳动物外周血细胞微核试验;GBZ/T 240. 11-20门I GBZ/T 240. 11-20门一一第37部分z体外哺乳动物细胞姊妹染色单体交换试验;一一第38部分:体内哺乳动物骨髓细胞姊妹染色体交换试验;一一第39部分:精子畸形试验;一二第40部分:繁殖/生长发育毒性筛选试验;一一第41部分:亚急性毒性合并繁殖/发育毒性筛选试验;第42部分z一代繁殖试验;一-第43部分:神经毒性筛选组合试验;一一第44部分:免疫毒性试验。本部分为GBZ/T240的第11部分。本部

6、分由卫生部职业卫生标准专业委员会提出。本部分由中华人民共和国卫生部批准。本部分起草单位:湖南省劳动卫生职业病防治所、广西职业病防治研究所、中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。本部分主要起草人t陆丹、陈晓琴、孙金秀、常兵、林铮。E GBZjT 240.11-20门1 范围化学晶毒理学评价程序和试验方法第11部分:体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验GBZ/T 240的本部分规定了哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验的目的、试验概述、试验方法、数据处理与结果评价、评价报告和结果解释。本部分适用于检测化学品的致突变作用。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，

7、仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GBZjT 224 职业卫生名词术语GBZ/T 240.1 化学品毒理学评价程序和试验方法第1部分:总则3 术语和定义GBZjT 240.1界定的术语和定义适用于本文件。3. 1 微核micronucJeus 在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然滞留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整条染色体。它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内而形成，因比主核小，故称为微核。3.2 3.3 3.4 着丝粒centronner

8、ejkinetochore 细胞分裂中期染色体上纺锤丝附着的区域，借此子代染色体得以有规律地向子代细胞两极移动。正染红细胞nornnochronnatic erythrocyte , NCE 核糖体己消失的成熟红细胞。晴多染红细胞polychronnatic erythrocyte, PCE 细胞质内仍含有核糖体的未成熟红细胞。4 试验目的检测受试样品是否能引起哺乳动物骨髓嗜多染红细胞染色体或有丝分裂器损伤而诱导含微核细胞发生率增高，以评价受试样品致突变的可能性。1 GBZ/T 240. 11-2011 5 试验概述通过适当的途径使动物接触受试样品，一定时间后处死动物，取出骨髓，制备涂片，经固

9、定、染色、在显微镜下计数含微核的嗜多染红细胞。6 试验方法6. 1 试剂6. 1. 1 小牛血清(灭活)小牛血清滤菌后置于560C恒温水浴保温30min进行灭活。灭活的小牛血清通常贮存于40C冰箱里。亦可用大鼠、小鼠血清代替。6.1.2 姬姆萨(Giemsa)染液Giemsa染料3.8 g 甲醇375 mL 甘油125 mL 配制:将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375mL，待完全溶解后，再加入125mL甘油，棍合均匀。置37C恒温箱中保温48ho保温期间振摇数次，促使染料的充分溶解。取出过滤，两周后使用。6. 1. 3 磷酸盐缓冲液(pH6.8)1/15 mol/L

10、磷酸氢二铀溶液z磷酸氢二铀(Na2HP04)9.47g溶于1000 mL蒸馆水中。1/15 mol/L磷酸二氢饵溶液z磷酸二氢怦(KH2P04)49.07 g溶于1000 mL蒸馆水中。取1/15mol/L磷酸氢二锅溶液50mL与1/15mol/L磷酸二氢饵溶液50mL混合。6. 1.4 Giemsa应用渣取1份Giemsa染液与9份1/15mol/L磷酸盐缓冲液混合而成。1临用时配制。6.1.5 甲醇(分析纯)全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为蒸馆水。6.2 受试样晶处理通常用蒸馆水、等渗盐水、植物油、食用淀粉、接甲基纤维素铀等。如使用特殊溶剂或载体，应有参考资料说明其成分。6.3 实

11、验动物常规选用成年的健康小鼠或大鼠。6.4 剂量设计至少设置三个剂量组，高剂量组应达到不产生动物死亡的最大毒作用剂量。一般取受试样品1/2LDso或低于1/2LDso的剂量，以求获得微核的剂量-反应关系曲线。当受试样品的LDso大于5g/kg体GBZ/T 240. 11-2011 重时，可取5g/kg体重为高剂量，每个剂量组10只动物，雌性、雄性各半，同时应设阳性对照和阴性对照。阳性对照物应能引起骨髓嗜多染红细胞微核率明显高于背景资料，染毒途径可以不同于受试样品。所选用的阳性对照物最好与受试样品类别有关，常使用的阳性对照物有:环磷酷股Ccyclophosphamide, CAS号50-18-0

12、); 一一甲磺酸乙醋Cethylmethan巳sulphonate，CAS号62-50-0); 一一-乙基亚硝基腮Cethylnitrosourea , CAS号759-73-9); 一一丝裂霉素CCmitomycinC，CAS号50-07-7); 一一三亚乙基嘈腊Ctriethylenemelamine, CAS号51-18-3)等。如使用特殊溶剂的应设溶剂对照。6.5 试验步骤6.5.1 染毒骨髓PCE微核试验要求给受试样品后短期内能在骨髓达到有效浓度。常用的方式是腹腔给药及经口给药。由于受试样品的理化性状各不相同，经各种途径给药后吸收速度及分布也有差异，故可按实际需要，选用合适的给药途径

13、。染毒途径视试验目的而定，宜采用经口灌胃方式。采用一次给药，于24 h48 h之间取材;还可采用30h两次给药法，即两次给药间隔24h，第二次给受试样品后6h 取材。6.5.2 取材颈椎脱臼处死动物后，打开胸腔，沿着胸骨柄与肋骨交界处剪断，剥掉附着其上的肌肉，擦净血污，横向剪开胸骨，暴露骨髓腔，然后用止血钳挤出骨髓液。6.5.3 标本片制备6.5.3.1 骨髓涂片将骨髓液滴在载玻片一端的小牛血清液滴里，仔细混匀。一般来讲，两节胸骨髓液涂一张玻片为宜。然后，按血常规涂片法涂片，长度约2cm3 cm。在空气中晾干。6.5.3.2 固定将干燥的涂片放入甲醇液中固定5min10 min。即使当日不染色

14、，也应固定后保存。6.5.3.3 染色将固定过的涂片放入Giemsa应用液中染色10min15 min。立即用蒸锢水冲洗，晾干。6.5.3.4 封片待染片完全干燥后或用滤纸及时擦干染片背面的水滴，再用双层滤纸轻轻按压染片，以吸附染片上残留的水分，再在空气中晃动数次，以促其尽快晾干，然后放入二甲苯中透明5min，取出滴上适量光学树胶，盖上盖玻片，写好标志。6.5.4 镜检6.5.4. 1 本法观察含微核的嗜多染红细胞。嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈淡桔红色。微核大多数呈单个圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质相一致，呈紫红色或蓝紫色。选择细胞分布均匀，细胞无损，着色适当的区域，再在油镜下计数。虽

15、然不计数含微核的有核细胞，但需用有核细胞形态染色是否FFON|=.O叮NHNSGBZ/T 240.11-2011 正常作为判断制片优劣的标准。6.5.4.2 应对每个动物的骨髓至少观察200个红细胞，计数嗜多染红细胞在红细胞总数(嗜多染红细胞+嗜正染红细胞)中比例时，嗜多染红细胞在红细胞总数中比例不应低于对照值的20%。如果PCE/NCEO.l，说明红细胞生成过程受到抑制，试验结果不可靠，应重新设计剂量，进行试验。6.5.4.3 每只动物至少计数1000个嗜多染红细胞。微核率指含有微核的嗜多染红细胞数，以千分率(%0)表示。若一个嗜多染红细胞中出现两个以上微核，仍按一个有微核细胞计数。并应计算

16、正常红细胞和嗜多染红细胞的比例。数据处理与结果评价计算各组微核细胞率的均数和标准差，用适当的统计学方法，对受试样品各剂量组与溶剂对照组的微核率进行比较。如果受试样品剂量组与对照组相比，统计学上有显著性差异，并有剂量-反应关系则可认为微核试验阳性。7 评价报告除GBZ/T240. 1规定的一般项目外，评价报告还应包括以下内容:a) 受试样品:配制方法、所用溶剂及其对受试样品的溶解性和稳定性;b) 动物:种属、品系、体重、数量、性别、来源(注明合格证号和动物级别)、喂养条件、饲料等;c) 实验动物饲养环境:饲料来源、室温、相对湿度、实验动物室合格证号;d) 试验方法:选定剂量依据、剂量换算、染毒途径和方式、试验处理与制片过程;e) 毒性评价:分析每只动物细胞数、试验干扰因素及评价方法等;f) 以列表方式报告受试样品对动物骨髓细胞微核发生率;g) 结论。8 结果解释阳性结果表明受试样品在本试验条件下可引起哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核率增加。阴性结果表明在本试验条件下受试样品不引起哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核率增加。9 A且-4u究-J必扭一权。r-4僵一1创一有印一专臼一权-2-陪1版非一副GBZ/T 240.11-2011 打印日期:2011年11月23日F002